發(fā)布時間：2020-11-20 19:39

　　 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,簡稱金葡菌)既是共生菌組成成分,也是侵襲性感染的主要原因。盡管對金葡菌感染的致病機理及其與宿主的相互作用進行了大量研究,但宿主清除金葡菌的機制仍未完全闡明,阻礙了控制該病原感染新策略的發(fā)展。天然免疫系統(tǒng)在早期識別和清除入侵病原體中起著關鍵作用。天然免疫細胞通過模式識別受體(PRRs)感知病原,啟動宿主防御機制。干擾素誘導蛋白204(IFI204,其人類同源蛋白為IFI16)是PRRs中的DNA傳感器。有關IFI16/IFI204參與免疫反應的研究目前多集中于對病毒基因組的識別和抑制病毒復制方面,此外還有數(shù)篇關于其介導宿主細胞對幾種胞內菌的識別和反應的相關研究報道,都是在體外基因敲降的基礎上進行的。未見到有關IFI16/IFI204介導胞外菌識別的相關研究。盡管金葡菌也能在細胞內生長和傳播,但通常被認為是細胞外致病菌。本課題應用IFI204基因缺失小鼠研究了IFI204在宿主防御金葡菌感染中的作用。在金葡菌呼吸道感染實驗中,與WT(野生型)對照小鼠相比,IFI204~(-/-)(IFI204基因缺失型)小鼠的肺、支氣管肺泡灌洗液(BALF)和血液中的荷菌量更多,肺損傷更加嚴重。在金葡菌全身性感染實驗中,IFI204~(-/-)小鼠的存活率顯著低于WT小鼠,血液和腎臟中具有更高的荷菌量,腎損傷更加嚴重。此外,金葡菌呼吸道感染顯著促進WT小鼠肺組織、BALF以及血液中細胞因子(IL-6,IL-1β、IFN-β)和趨化因子(KC/CXCL1?CXCL2?CXCL10)的表達,以及肺組織嗜中性粒細胞和巨噬細胞趨化。但感染后IFI204~(-/-)小鼠這些細胞因子/趨化因子的表達水平和肺內炎性細胞募集量都顯著低于WT對照。這表明IFI204參與了宿主抗金葡菌感染的免疫防御,能抑制金葡菌增殖,減輕組織病理損傷,降低死亡率,并能在感染早期促進炎性細胞因子分泌和炎性細胞募集,在宿主防御金葡菌感染中發(fā)揮著不可或缺的保護作用。檢測發(fā)現(xiàn)IFI204在金葡菌感染小鼠肺組織中主要表達于募集的炎性細胞,還發(fā)現(xiàn)巨噬細胞表達的IFI204主要定位于細胞核,且金葡菌能顯著上調其表達,故以小鼠巨噬細胞作為體外研究的主要細胞。金葡菌明顯誘導了WT巨噬細胞IFN-β和KC的表達,而感染后IFI204~(-/-)巨噬細胞IFN-β和KC的表達水平顯著低于WT對照。IFI204對金葡菌基因組DNA誘導的IFN-β和KC表達具有相似的調節(jié)作用。這進一步證實了IFI204促進金葡菌誘導的炎性細胞因子分泌。針對其信號傳遞機制的研究中,結合體內和體外實驗分析了在DNA觸發(fā)的IFN-β誘導中起關鍵作用的STING-IRF3信號通路,以及在炎性反應、免疫應答等過程中起關鍵作用的NF-κB信號通路。在IFI204~(-/-)巨噬細胞中,金葡菌或其基因組DNA誘導的STING和IRF3活化水平顯著低于WT巨噬細胞,并且NF-κB信號也受損。體內實驗結果與此一致,證明IFI204促進了金葡菌誘導STING-IRF3和NF-κB炎性信號的活化。此外,實驗發(fā)現(xiàn)重組細胞因子rKC和rIFN-β都不能抑制金葡菌呼吸道感染IFI204~(-/-)小鼠肺組織和血液中的細菌增殖,而用anti-IFNAR1單克隆中和抗體阻斷I型IFN信號反而顯著降低了金葡菌全身性感染IFI204~(-/-)小鼠的死亡率,表明IFI204在宿主防御金葡菌感染中的保護作用并不依賴于炎性細胞因子IFN-β和KC。為明確IFI204抗金葡菌感染免疫防御作用的機制,進而針對IFI204~(-/-)吞噬細胞對金葡菌的吞噬作用、胞內殺傷和胞外殺傷分別進行了實驗,以探討IFI204對吞噬細胞金葡菌清除能力的影響。金葡菌感染的IFI204~(-/-)巨噬細胞與WT巨噬細胞內吞的活金葡菌或熱滅活金葡菌數(shù)量相等,慶大霉素處理后細胞內存活的金葡菌數(shù)量也相等,但IFI204~(-/-)巨噬細胞胞外活菌數(shù)量顯著多于WT巨噬細胞。這表明IFI204并不影響巨噬細胞對金葡菌的內吞和胞內殺傷,但能促進其胞外殺菌活性。胞外誘捕網(wǎng)(ETs)是天然免疫防御中的一種胞外殺菌機制。與WT對照細胞相比,金葡菌感染后的IFI204~(-/-)巨噬細胞和嗜中性粒細胞的ETs形成顯著減少,胞外殺菌能力下降。IFI204缺失也抑制PMA誘導的胞外DNA釋放,表明IFI204能促進吞噬細胞ETs形成,提高其胞外殺菌能力。為進一步證實,對小鼠移植骨髓細胞后,再進行金葡菌呼吸道感染。與接受IFI204~(-/-)小鼠骨髓細胞的IFI204~(-/-)受體小鼠相比,接受WT小鼠骨髓細胞的IFI204~(-/-)受體小鼠感染后荷菌量較少、肺組織損傷較輕,炎性細胞募集增加、MPO活性增加,肺中的促炎細胞因子(KC、IL-1β、IL-6)也表現(xiàn)為相似變化趨勢。這表明移植WT小鼠的骨髓細胞能夠挽救IFI204~(-/-)小鼠由于金葡菌感染造成的肺損傷,恢復其炎性細胞募集能力和金葡菌清除能力,證實IFI204在宿主防御金葡菌感染中的保護作用依賴于骨髓來源的吞噬細胞等免疫細胞。綜上所述,本課題證明了IFI204參與宿主抗金葡菌感染的免疫防御,能抑制金葡菌增殖和組織病理損傷,從而在金葡菌感染時對宿主起到保護作用,并能在感染早期促進炎性細胞因子分泌和炎性細胞募集。然而,IFI204的這一保護作用并不依賴于炎性細胞子IFN-β和KC,但依賴于骨髓來源的吞噬細胞等免疫細胞,且IFI204能促進金葡菌感染吞噬細胞ETs形成,從而增強吞噬細胞的胞外殺菌能力。這些發(fā)現(xiàn)揭示了IFI204在宿主防御胞外菌金葡菌感染中的重要作用和機制。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

吉林大學博士學位論文應 1 分鐘，35 個循環(huán)；72℃反應 10 分鐘，4℃降溫。電泳跑膠，條帶為 482 bp，IFI204-/-小鼠的目的條帶為 582 bp。鑒定結果如物信息如下：因 引物序列 產(chǎn)04 WT上游 CTTCAGTCCACGTACCAAGAGC4下游 GCTAGAGCAAGATACCAACACTCG4 mutant上游 CTTCAGTCCACGTACCAAGAGC5下游 TCTGAGGCGGAAAGAACCAG

圖 1.2 金葡菌呼吸道感染后 IFI204-/-小鼠荷菌量高于 WT 小鼠Figure 1.2 IFI204-/-mice had higher bacterial burden compare with WT mice afteStaphylococcus pulmonary infection.A.肺臟；B.支氣管肺泡灌洗液；C.腎臟；D.肝臟；E.脾臟；F.血液；*p<0.05A.Lung；B.BALF；C.Kidney；D.Liver；E.Spleen；F.Blood；*stands for p<0.0病理學檢測實驗中，肉眼觀察小鼠肺臟病變情況，發(fā)現(xiàn)金葡菌呼吸道感染肺臟都可見深紅色的病變區(qū)，但 IFI204-/-小鼠肺組織眼觀病變與 WT 對照小比更嚴重（圖 1.3）。金葡菌呼吸道感染肺組織切片 H&E 染色觀察，發(fā)現(xiàn)未小鼠支氣管腔、肺泡腔內沒有炎性細胞浸潤，肺泡結構完整；金葡菌感染 W鼠肺組織出現(xiàn)炎性細胞浸潤和紅細胞滲出，肺泡減少，肺泡間隔毛細血管充血葡菌感染 IFI204-/-小鼠的肺組織損傷更為嚴重，可見肺組織嚴重充血，甚至實變，肺泡萎縮、消失或融合成肺大泡（圖 1.4）。這提示 IFI204 對金葡菌呼

圖 1.3 金葡菌呼吸道感染 IFI204-/-小鼠肺組織眼觀病變與 WT 小鼠相比更嚴重Figure 1.3 The pathological changes in lung tissues of IFI204-/-mice were moresevere compare with WT mice after Staphylococcus pulmonary infection.圖 1.4 金葡菌呼吸道感染 IFI204-/-小鼠肺病理學損傷與 WT 小鼠相比更嚴重
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本文編號：2891898