發(fā)布時間：2020-11-16 00:41

　　 奶牛乳房炎是世界范圍內(nèi)給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失的常見疾病,病原微生物感染是奶牛乳房炎發(fā)生的主要原因,目前已報道的病原微生物多達150種�？耸蠙幟仕釛U菌(Citrobacter koseri,C.koseri)是一種環(huán)境條件致病菌,最早認為是奶牛腸道菌群的正常寄居菌,近年來多個國家已從奶牛乳房炎的乳樣中分離到了該菌,但缺乏進一步的研究,對C.koseri生物學(xué)特性和鞭毛素基因fliC的功能認識不清。本試驗對奶牛乳房炎樣品進行了C.koseri的分離鑒定和生物學(xué)特性研究,構(gòu)建了鞭毛素基因fliC的突變株,進行了鞭毛素基因fliC的功能驗證,取得了以下結(jié)果:1.從奶牛乳房炎分離到1株G~-桿菌,經(jīng)形態(tài)學(xué)檢查、生化鑒定、16S rRNA序列測定和系統(tǒng)進化分析,確定該菌為C.koseri,將其命名為CKO-WT99。2.CKO-WT99可引起小鼠死亡和小鼠乳房炎,是奶牛乳房炎的致病菌。CKO-WT99對青霉素和氨芐西林耐藥,對其他抗生素敏感;CKO-WT99可作為受體菌接受blaCTX-M-55,并通過接合轉(zhuǎn)移將blaCTX-M-55轉(zhuǎn)移到野生型的E.coli中;CKO-WT99具有運動性,含有鞭毛素基因fliC;CKO-WT99生物被膜主要成分為卷曲菌毛和纖維素。3.以CKO-WT99基因組為模板,使用重疊PCR的方法將fliC上下游同源臂融合到一塊,將融合片段克隆到自殺性質(zhì)粒pRE112上,構(gòu)建出重組自殺性質(zhì)粒pREΔfliC,以E.coli X7213(含重組自殺性質(zhì)粒pREΔfliC)為供體菌,CKO-WT99為受體菌進行共培養(yǎng),兩步法篩選出缺失株ΔfliC,并使用自殺性質(zhì)粒pRE112對ΔfliC進行了回補。4.CKO-WT99、缺失株ΔfliC、ΔfliC-C三株菌生化特性和生長特性基本沒有差別;缺失株ΔfliC與CKO-WT99相比生物被膜形成能力下降、喪失運動性、不形成鞭毛、毒力降低,回補株ΔfliC-C基本恢復(fù)這些能力,說明鞭毛素基因fliC是C.koseri的結(jié)構(gòu)基因和毒力基因。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.61
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號對照表
第一章 文獻綜述
    1.1 克氏檸檬酸桿菌的研究進展
        1.1.1 大腸埃希菌、沙門氏菌和克氏檸檬酸桿菌的生物被膜研究現(xiàn)狀
        1.1.2 克氏檸檬酸桿菌β-內(nèi)酰胺酶的耐藥現(xiàn)狀
    1.2 鞭毛的研究進展
        1.2.1 鞭毛介導(dǎo)的運動性和趨化性
        1.2.2 鞭毛在黏附和侵襲中的作用
        1.2.3 鞭毛基因與毒力基因協(xié)調(diào)表達
        1.2.4 鞭毛對生物被膜的作用
        1.2.5 鞭毛調(diào)節(jié)真核細胞的免疫系統(tǒng)
        1.2.6 鞭毛素基因fliC的研究
第二章 克氏檸檬酸桿菌的生物學(xué)特性
    2.1 材料
        2.1.1 乳樣采集
        2.1.2 主要試劑、試劑盒及儀器
        2.1.3 試驗動物和菌株
        2.1.4 引物
    2.2 方法
        2.2.1 CKO-WT99 的分離及生化鑒定
        2.2.2 16S rRNA基因序列的擴增及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建
        2.2.3 小鼠致病性試驗
        2.2.4 CKO-WT99 感染對小鼠乳腺組織的損傷
        2.2.5 CKO-WT99 的耐藥性試驗
        2.2.6 接合轉(zhuǎn)移試驗
        2.2.7 CKO-WT99 運動性分析
        2.2.8 CKO-WT99 生物被膜主要成分檢測
        2.2.9 CKO-WT99 鞭毛和生物被膜有關(guān)基因的檢測
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 CKO-WT99 的分離與生化鑒定
        2.3.2 16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建
        2.3.3 小鼠致病性試驗
        2.3.4 CKO-WT99 感染對小鼠乳腺組織的損傷
        2.3.5 CKO-WT99 的耐藥性試驗
        2.3.6 接合轉(zhuǎn)移試驗
        2.3.7 CKO-WT99 運動性檢測
        2.3.8 CKO-WT99 生物被膜主要成分檢測
        2.3.9 CKO-WT99 鞭毛和生物被膜有關(guān)基因的檢測結(jié)果
    2.4 討論
        2.4.1 CKO-WT99 的分離鑒定
        2.4.2 CKO-WT99 的生物學(xué)特性研究
    2.5 小結(jié)
第三章 克氏檸檬酸桿菌鞭毛素基因fliC的功能
    3.1 材料
        3.1.1 菌株與質(zhì)粒
        3.1.2 主要試劑、試劑盒及儀器
        3.1.3 試驗動物
        3.1.4 引物
    3.2 方法
        3.2.1 CKO-WT99 的復(fù)蘇及基因組的提取
        3.2.2 PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的純化回收
        3.2.3 質(zhì)粒小提
        3.2.4 缺失株ΔfliC的構(gòu)建
        3.2.5 回補株ΔfliC-C的構(gòu)建
        3.2.6 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回補株ΔfliC-C的生化特性
        3.2.7 缺失株ΔfliC和回補株ΔfliC-C的遺傳穩(wěn)定性
        3.2.8 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回補株ΔfliC-C生長特性
        3.2.9 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回補株ΔfliC-C鞭毛形態(tài)觀察
        3.2.10 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回補株ΔfliC-C運動性檢測
        3.2.11 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回補株ΔfliC-C生物被膜半定量檢測
        3.2.12 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回補株ΔfliC-C LD50 檢測
        3.2.13 統(tǒng)計學(xué)分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 重組自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 缺失株 ΔfliC的構(gòu)建及鑒定
        3.3.3 回補株 ΔfliC-C的構(gòu)建
        3.3.4 CKO-WT99、缺失株 ΔfliC和回補株 ΔfliC-C生化特性
        3.3.5 缺失株 ΔfliC和回補株 ΔfliC-C的遺傳穩(wěn)定性
        3.3.6 CKO-WT99、缺失株 ΔfliC和回補株 ΔfliC-C生長特性
        3.3.7 CKO-WT99、缺失株 ΔfliC和回補株 ΔfliC-C鞭毛形態(tài)觀察
        3.3.8 CKO-WT99、缺失株 ΔfliC和回補株 ΔfliC-C運動性檢測
        3.3.9 CKO-WT99、缺失株 ΔfliC和回補株 ΔfliC-C生物被膜半定量檢測
        3.3.10 CKO-WT99、缺失株 ΔfliC和回補株 ΔfliC-C LD50 檢測
    3.4 討論
        3.4.1 CKO-WT99 鞭毛素基因fliC的功能研究
        3.4.2 CKO-WT99 缺失株的構(gòu)建
        3.4.3 CKO-WT99 回補株的構(gòu)建
    3.5 小結(jié)
第四章 結(jié)論
附錄A CKO-WT99 16S rRNA序列
參考文獻
致謝
個人簡歷

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本文編號：2885410