發(fā)布時(shí)間：2020-11-15 13:54

　　 牛輪狀病毒感染(Bovine rotavirus,BRV)又稱犢牛腹瀉病毒(Calf diarrhea virus),由輪狀病毒(Rotavirus,RV)引起的,RV屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavirus)。輪狀病毒是引起全世界幼兒和幼齡動(dòng)物腹瀉的主要原因。在養(yǎng)牛業(yè),主要引起牛群腹瀉、精神沉郁、厭食、脫水,甚至引起酸中毒死亡;牛輪狀病毒病的感染多發(fā)生在1月齡以內(nèi)的犢牛,其中7日齡以內(nèi)的犢牛最易感染,通常在12~24 h即可引起犢牛嚴(yán)重腹瀉,發(fā)病率為90%~100%,病死率最高可達(dá)50%。不僅能使奶牛產(chǎn)奶量下降而且會嚴(yán)重地影響病愈犢牛的生長發(fā)育;在成年牛中RV多呈隱性感染并在一定的時(shí)間排毒,造成持續(xù)感染。更重要的是患牛易繼發(fā)細(xì)菌感染或與其他病毒混合感染,導(dǎo)致病情惡化,死亡率升高。RV是11個(gè)基因片段組成的雙鏈RNA(dsRNA)病毒,它易通過點(diǎn)突變發(fā)生抗原變異、抗原漂移,產(chǎn)生新毒株,甚至造成種間傳播,擴(kuò)大感染宿主,危害更多的哺乳動(dòng)物和禽類。為了對寧夏回族自治區(qū)患有消化道系統(tǒng)疾病的舍飼牛進(jìn)行病原鑒定,本研究主要通過RT-PCR、PCR方法,對2017年來自寧夏某牛場腹瀉牛的糞便進(jìn)行RV檢測。將陽性樣品在MA-104細(xì)胞上進(jìn)行病毒分離,病毒在細(xì)胞上盲傳3代后出現(xiàn)細(xì)胞病變,直至第5代細(xì)胞病變明顯,收獲病毒培養(yǎng)物。成功分離到1株牛輪狀病毒,并將其命名為NX23。根據(jù)RVA設(shè)計(jì)11個(gè)基因片段的擴(kuò)增引物,對NX23進(jìn)行全基因組擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接在pMD18-T載體上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行亞克隆,將陽性的克隆菌進(jìn)行序列測定。獲得該分離株完整的編碼區(qū)核苷酸序列,長度為17 427 bp,并利用RotaC~(2.0)、DNA Star與GenBank上的RV序列進(jìn)行進(jìn)化樹、同源性分析。本研究對腹瀉樣品中的BRV進(jìn)行分離鑒定,對NX23的全基因組編碼區(qū)核苷酸序列進(jìn)行分析。利用A群輪狀病毒自動(dòng)分型工具RotaC~(2.0),確定該毒株的VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5的基因型分別是:G8-P[1]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2。將NX23的11個(gè)基因片段與GenBank上檢索到的不同血清群、不同基因型的RV序列進(jìn)行分析。NX23的VP7基因片段與G8型的人、牛、猴、豬、羊、羊駝分離株形成一個(gè)小分支,而與人分離株MUL-13-204的VP7片段在進(jìn)化樹上最為接近。NX23的VP4基因片段與P[1]型人、牛、羊、羊駝、猴分離株形成一個(gè)小分支,而與牛分離株O Agent的VP4片段在進(jìn)化樹上最為接近。NX23的VP6基因片段與I2型人、牛、羊、羊駝、角鹿、羚羊、駱駝、兔分離株形成一個(gè)小分支,而與人分離株RV176的VP6片段在進(jìn)化樹上最為接近。NX23的VP1基因片段與R2型人、牛、羊、羊駝、角鹿、羚羊、貓、猴分離株形成一個(gè)小分支,而與人分離株1473的VP1片段在進(jìn)化樹上最為接近。NX23的VP2基因片段與C2型人、牛、羊、羊駝、角鹿、犬、貓、兔、駱駝分離株形成一個(gè)小分支,而與人分離株MUL-13-204的VP2片段在進(jìn)化樹上最為接近。NX23的VP3基因片段與M2型人、牛、羊、羊駝、角鹿、豬、貓、駱駝分離株形成一個(gè)小分支,而與駱駝分離株MRC-DPRU447的VP3片段在進(jìn)化樹上最為接近。分離株NX23的NSP1基因片段與A2型人分離株形成一個(gè)小分支,與人分離株MUL-13-204的NSP1片段在進(jìn)化樹上最為接近。NX23的NSP2基因片段與N2型人、牛、羊、蝙蝠、角鹿、羚羊、犬、貓、兔、猴、駱駝分離株形成一個(gè)小分支,而與人分離株RV176的NSP2片段在進(jìn)化樹上最為接近。NX23的NSP3基因片段與T2型人分離株形成一個(gè)小分支,與人分離株MUL-13-204的NSP3片段在進(jìn)化樹上最為接近。NX23的NSP4基因片段與E2型人、牛、羊、蝙蝠、角鹿、羚羊、馬、貓、兔、猴、駱駝、疫苗分離株形成一個(gè)小分支,而與人分離株DRC86的NSP4片段在進(jìn)化樹上最為接近。NX23的NSP5基因片段與H2型人分離株形成一個(gè)小分支,與人分離株DS-1的NSP5片段在進(jìn)化樹上最為接近。根據(jù)進(jìn)化樹分析,推測牛分離株NX23可能為多物種來源的RV重配產(chǎn)物。本研究分析分離株NX23基因組遺傳變異特點(diǎn)為研究BRV遺傳變異規(guī)律提供參考。對防范牛源人獸共患病、輪狀病毒的流行病學(xué)研究和基礎(chǔ)研究層面具有多重意義。掌握BRV流行毒株的變異規(guī)律不但有利于BRV的防控,而且為評估疫苗免疫保護(hù)效力及新疫苗的研發(fā)具有指導(dǎo)意義。
【學(xué)位單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

BRVPCR鑒定250100188bp

圖 3-2 MA-104 細(xì)胞的病變A：病變細(xì)胞；B：正常細(xì)胞Fig. 3-2 Cytopathic effect of MA-104 cellsA: Infected cell; B: Mock-infected cell
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本文編號：2884829