發(fā)布時間：2020-11-15 11:30

　　 δ-冠狀病毒(Deltacoronavirus,DCoV)是冠狀病毒科的新成員,能夠感染哺乳動物和禽類。2012年中國香港首次報道了豬δ-冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV),它能夠引起豬只發(fā)生嘔吐和水樣腹瀉,嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。到目前為止,PDCoV感染宿主細胞的過程尚不清楚,病毒粒子與其特異性受體結(jié)合是感染發(fā)生的首要條件,因此鑒定出PDCoV的受體,有望從分子水平上闡明PDCoV入侵宿主細胞中分子機制,為新型疫苗研制提供理論支持,同時也為德爾塔冠狀病毒的受體研究奠定了基礎(chǔ)。不同種屬間冠狀病毒受體差異較大,本研究根據(jù)已有的研究基礎(chǔ),經(jīng)過合理的推斷,以已知的豬冠狀病毒受體豬氨基肽酶N(pAPN)和唾液酸分子(Sialic acid)為研究對象,通過對PDCoV非易感細胞乳鼠腎細胞(BHK-21)過表達,及易感細胞豬睪丸細胞(ST)過表達和RNA干擾試驗(siRNA),細胞受體阻斷試驗等進行驗證。結(jié)果表明pAPN和Sialic acid分子對PDCoV在易感細胞ST中復(fù)制并無影響,其不是PDCoV入侵宿主細胞的受體,這為PDCoV致病分子機理的研究帶來了新的參考依據(jù)。相關(guān)研究表明冠狀病毒識別相應(yīng)的受體并成功進入到宿主細胞,是由纖突(Spike,S)蛋白完成的。S蛋白是一種大的I型跨膜糖蛋白,按其功能不同,又將其分為位于N端的S1和位于C端的S2,而S1主要介導(dǎo)病毒與受體分子的結(jié)合。PDCoV能感染ST細胞,且能在ST細胞上繁殖,說明ST細胞表面存在PDCo V的受體分子。為進一步篩選鑒定PDCoV的受體,在此理論基礎(chǔ),本研究建立了PDCo V-S1蛋白真核表達純化系統(tǒng),使表達的PDCoV-S1蛋白接近天然蛋白的復(fù)雜構(gòu)象,用免疫沉淀法(IP)法釣出ST細胞中與S蛋白相互作用的蛋白,經(jīng)質(zhì)譜鑒定篩選到了可能的受體分子,通過對其基因沉默、過表達,我們發(fā)現(xiàn)宿主蛋白熱休克蛋白90AB1(p HSPCB)在PDCoV感染中起重要作用,結(jié)果表明pHSPCB上調(diào)表達促進PDCoV復(fù)制,p HSPCB被小分子干擾RNA敲低則抑制PDCoV復(fù)制,該蛋白有利于PDCoV在易感細胞ST細胞中增殖。本研究揭示了pAPN和Sialic acid不是PDCo V的受體分子,而熱休克蛋白90AB1(p HSPCB)能促進PDCoV感染豬睪丸細胞,本研究結(jié)果為PDCoV侵入機制提供了新的參考依據(jù)。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

冠狀病毒（Coronaviruses, CoVs）屬于尼多病毒目（Nidovirales）、冠狀病毒科（Coronavirinae）該病毒的宿主范圍廣，包括人、禽類及其他哺乳動物 (Jonassen et al., 2016; Liu et al., 2005; Van dehoek et al., 2004; Woo et al., 2009)。其中，δ-冠狀病毒（Delatcoronavirus, DCoV）是2011年國際病毒分類委員會（The International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV）新分出的冠狀病毒屬δ-冠狀病毒最早于2007年，從中國白鼬獾和亞洲豹貓中檢測得到 (Dong et al., 2007; Woo et al.2012)。而豬δ-冠狀病毒（Porcine delatcoronavirus, PDCoV）是2012年新發(fā)現(xiàn)的一種豬冠狀病毒，現(xiàn)已證實PDCoV具有較強的致病性，能導(dǎo)致母豬、仔豬發(fā)生水樣腹瀉、嘔吐等，哺乳仔豬感染后死亡率可達30%~40% (Wang et al., 2014)，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。DCoV不僅感染哺育動物，還感染野禽，對公共安全具有潛在的威脅性，到目前為止DCoV感染宿主細胞的過程尚不清楚。1.1.1 PDCoV 分類地位PDCoV屬于尼多病毒目（Nidovirales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒亞科（Coronavirus）、δ-冠狀病毒屬（Deltacoronavirus）的成員，如圖1.1所示。

圖1.2 PDCoV粒子結(jié)構(gòu)和形態(tài)Fig. 1.2 The Architecture and morphology of PDCoV virionA：冠狀病毒粒子結(jié)構(gòu)；B：PDCoV粒子形態(tài)（PDCoV NH株，負染染色）rchitecture of coronavirus particles (Sandrineet et al., 2012); B: The morphology of PDCoV virion (NHCoV 基因組結(jié)構(gòu)oV基因組長度是所有冠狀病毒家族中最小的，約為25 kb (方譜縣等，2016)，其基到3′端依次為：5′非編碼區(qū)（UTR）、開放閱讀框1a/1b（ORF1a/1b）、S基因、非結(jié)構(gòu)蛋白6（nsp6）、N基因、非結(jié)構(gòu)蛋白7（nsp7）和3′UTR，如圖1.3所示 (′端2/3的基因組，編碼兩個較大重疊的開放閱讀框ORF1a和ORF1b，其編碼兩個pp1ab。根據(jù)對其他冠狀病毒的研究，PDCoV的多聚蛋白pp1a和pp1ab通常被病毒割、加工形成16個成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白，其主要與病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄有關(guān) (Hurst et al., 2后1/3編碼四個結(jié)構(gòu)蛋白，依次是纖突蛋白（Spike, S）、小膜蛋白（Small memberaMemberane, M）以及核衣殼蛋白（Nucleocapsid, N），以及輔助蛋白（Accessory pNS7，預(yù)計NS6位于在基因組中的M和N之間，而NS7則位于N基因內(nèi)的一個ORF廣泛分布于冠狀病毒基因組中 (Riffault et al., 1997; Surjit et al., 2006; Woo et al

易感細胞表面的特異性受體結(jié)合完成的 (Brierley et al., 1989)。研究表明，病毒受體大多屬于蛋白質(zhì)，也有脂類或糖脂 (Adriaan, 2017)。冠狀病毒感染宿主細胞的過程，以SARS冠狀病毒為例，如圖1.4所示 (Adriaan, 2017)。冠狀病毒復(fù)制周期是從翻譯病毒基因組的5'端ORF開始（ORF1a和ORF1b），其合成兩個多聚蛋白pp1a和pp1ab，通過兩個或三個ORF1a編碼的蛋白酶的切割，蛋白水解后，從pp1a和pp1ab釋放15或16個復(fù)制酶蛋白 (Brierley and Dos Ramos, 2006)。在復(fù)制酶的作用下，病毒基因組通過不連續(xù)轉(zhuǎn)錄模式，轉(zhuǎn)錄生成新的基因組RNA和亞基因組mRNA，接著進入細胞質(zhì)，開始翻譯過程：基因組RNA首先開始翻譯，產(chǎn)生病毒RNA復(fù)制所需的蛋白酶；其次是亞基因組翻譯
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本文編號：2884712