發(fā)布時(shí)間：2020-11-14 05:07

【摘要】：奶牛乳房炎是奶牛的主要疾病之一,對(duì)全世界的奶牛養(yǎng)殖業(yè)以及乳制品行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。引起奶牛乳房炎的病原除了常見(jiàn)的金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、大腸桿菌等以外,凝固酶陰性葡萄球菌引起的感染呈上升趨勢(shì),已成為引起奶牛乳房炎發(fā)生病原的新特點(diǎn)。其中,木糖葡萄球菌在凝固酶陰性葡萄球菌引起的奶牛乳房炎病例中的分離率呈逐年上升趨勢(shì),已成為主要的病原菌。奶牛感染后主要利用抗菌藥物進(jìn)行治療,細(xì)菌長(zhǎng)期處于藥物選擇壓力下,逐漸進(jìn)化為對(duì)該藥物的耐藥菌,甚至進(jìn)化成為對(duì)其他種類藥物的多重耐藥菌,這給建立臨床合理用藥方案帶來(lái)困難。因此,探究不同種類藥物之間交叉耐藥機(jī)制對(duì)于指導(dǎo)臨床合理用藥及抗菌藥物減量使用意義重大。泰樂(lè)菌素作為大環(huán)內(nèi)酯類藥物中一種,被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床中。其作用機(jī)制為阻止肽�；鵷RNA從mRNA的“A”位移向“P”位,使氨�；鵷RNA不能結(jié)合到“A”位,從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成。氟苯尼考作為酰胺醇類藥物中的一種畜禽專用藥物,也被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床中,是一種典型的肽基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,阻止tRNA結(jié)合到A位,通過(guò)抑制肽鍵形成,競(jìng)爭(zhēng)性地阻止轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài),從而抑制肽基轉(zhuǎn)移酶的活性。以往研究表明,細(xì)菌在單一藥物選擇壓力下,會(huì)進(jìn)化出對(duì)其他種類藥物的耐藥表型。但目前尚未見(jiàn)木糖葡萄球菌對(duì)泰樂(lè)菌素和氟苯尼考交叉耐藥機(jī)制的相關(guān)研究。故本研究擬通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),初步確定可能與交叉耐藥相關(guān)的蛋白;以體外誘導(dǎo)獲得的泰樂(lè)菌素耐藥木糖葡萄球菌為研究對(duì)象,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR探究上述耐藥相關(guān)蛋白在木糖葡萄球菌交叉耐藥機(jī)制中的作用,闡明其在進(jìn)化過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律,確定與交叉耐藥相關(guān)的耐藥蛋白;利用分子克隆、基因測(cè)序、同源模建、分子對(duì)接以及基因組定點(diǎn)突變的方法,闡明木糖葡萄球菌對(duì)泰樂(lè)菌素和氟苯尼考交叉耐藥的分子機(jī)制。具體研究結(jié)果如下:(1)木糖葡萄球菌對(duì)泰樂(lè)菌素和氯霉素類藥物可能存在交叉耐藥現(xiàn)象,推斷與“轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白”和“壓力應(yīng)激相關(guān)蛋白”有關(guān)。1/2 MIC(0.25μg/mL)泰樂(lè)菌素選擇壓力下,利用蛋白質(zhì)組學(xué)i TRAQ技術(shù),獲得木糖葡萄球菌的差異表達(dá)蛋白。根據(jù)差異表達(dá)蛋白選擇標(biāo)準(zhǔn),即ratio1.2 or0.8(p-value0.05),篩選并鑒定出155個(gè)差異表達(dá)蛋白。其中氯霉素耐藥蛋白上調(diào)1.69倍,提示泰樂(lè)菌素選擇壓力下,木糖葡萄球菌可能進(jìn)化為對(duì)氯霉素類藥物耐藥菌。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明差異表達(dá)蛋白主要聚類成與“轉(zhuǎn)錄相關(guān)”(核糖體蛋白L23(rplw)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子IF-2(infB)和“壓力應(yīng)激相關(guān)”(過(guò)氧化氫酶(Kat)、硫氧還蛋白(trxA)、醛脫氫酶(aldA-1)、伴侶蛋白(gros)和L-乳酸脫氫酶(ldh))的兩類蛋白。(2)泰樂(lè)菌素耐藥木糖葡萄球菌對(duì)氟苯尼考交叉耐藥。以泰樂(lè)菌素為誘導(dǎo)藥物,利用實(shí)驗(yàn)室體外強(qiáng)誘導(dǎo)方式,獲得泰樂(lè)菌素耐藥木糖葡萄球菌,并考察其對(duì)氯霉素類藥物氟苯尼考的耐藥性,由0.5μg/mL升高至8μg/mL。(3)“轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白”、“壓力應(yīng)激相關(guān)蛋白”以及氯霉素耐藥蛋白可能在木糖葡萄球菌進(jìn)化為對(duì)泰樂(lè)菌素和氟苯尼考交叉耐藥的過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用�；�于不同水平的泰樂(lè)菌素耐藥木糖葡萄球菌,利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)測(cè)定“轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白”(核糖體蛋白L23(rplw)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子IF-2(infB))、“壓力應(yīng)激相關(guān)蛋白”(過(guò)氧化氫酶(Kat)、硫氧還蛋白(trxA)、醛脫氫酶(aldA-1)、伴侶蛋白(gros)和L-乳酸脫氫酶(ldh))以及氯霉素耐藥蛋白(cl)的表達(dá)水平,結(jié)果表明,隨著耐藥水平的升高,耐藥蛋白均發(fā)生規(guī)律性變化,其中核糖體蛋白L23上調(diào)表達(dá)2.8倍、硫氧還蛋白上調(diào)表達(dá)4.2倍、醛脫氫酶上調(diào)表達(dá)2.4倍、伴侶蛋白上調(diào)表達(dá)5.93倍和氯霉素耐藥蛋白上調(diào)1.5倍,L-乳酸脫氫酶下調(diào)2.5倍,而轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和過(guò)氧化氫酶表達(dá)并未發(fā)生差異性改變。(4)木糖葡萄球菌對(duì)泰樂(lè)菌素和氟苯尼考交叉耐藥可能與核糖體突變相關(guān),包括核糖體蛋白L3 N135G、A137G、S142A和R162K、L4 S158N和A164E、L22 97KRTSAIN98氨基酸插入以及23S rRNA A2662C、C1305A和T2560C。利用基因克隆、DNA測(cè)序以及DNAMAN序列比對(duì)分析,初步確定可能與交叉耐藥相關(guān)的核糖體突變位點(diǎn),利用PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中與木糖葡萄球菌核糖體蛋白L3、L4和L22一級(jí)序列同源性較高的金黃色葡萄球菌氨基酸序列作為模板進(jìn)行同源模建,并對(duì)構(gòu)建的蛋白進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)估。在此基礎(chǔ)上,利用CDOCKER方法,采用盲對(duì)接方式,將同源模建的核糖體蛋白與泰樂(lè)菌素和氟苯尼考分別進(jìn)行分子對(duì)接,通過(guò)能量運(yùn)算預(yù)測(cè)可能的結(jié)合位點(diǎn)。綜合以上兩部分結(jié)果確定可能與交叉耐藥相關(guān)的核糖體突變位點(diǎn)為核糖體蛋白L3 N135G、A137G、S142A和R162K,L4 S158N和A164E、L22 97KRTSAIN98氨基酸插入以及23S rRNA A2662C、C1305A和T2560C。(5)通過(guò)構(gòu)建上述可能與交叉耐藥相關(guān)的核糖體突變菌株,說(shuō)明核糖體蛋白L2297KRTSAIN98氨基酸插入、23S rRNA A2662C、C1305A和T2560C突變是導(dǎo)致木糖葡萄球菌對(duì)泰樂(lè)菌素和氟苯尼考交叉耐藥機(jī)制之一。利用同源重組的方法,對(duì)木糖葡糖球菌基因組進(jìn)行定點(diǎn)突變,同時(shí)引入綠熒光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)篩選標(biāo)簽,通過(guò)流式細(xì)胞儀篩選以及對(duì)突變片段DNA測(cè)序,最終獲得6株基因突變菌株即木糖葡萄球菌rplC基因突變菌株、木糖葡萄球菌rplD基因突變菌株、木糖葡萄球菌rplV基因突變菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA A2662C基因突變菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA C1305A基因突變菌株和木糖葡萄球菌23S rRNA T2560C基因突變菌株。并對(duì)其耐藥表型進(jìn)行考察,結(jié)果表明木糖葡萄球菌rplV基因突變菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA A2662C基因突變菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA C1305A基因突變菌株和木糖葡萄球菌23S rRNA T2560C基因突變菌株對(duì)泰樂(lè)菌素的MIC由0.5μg/mL升高至128μg/mL,對(duì)氟苯尼考的MIC由0.5μg/mL升高至2μg/mL。(6)利用計(jì)算機(jī)分子模擬,構(gòu)建木糖葡萄球菌rRNA結(jié)構(gòu),將其與泰樂(lè)菌素和氟苯尼考分別進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)果表明23S rRNA A2275是兩個(gè)藥物的交叉結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)探究交叉結(jié)合位點(diǎn)與突變位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)關(guān)系,闡明上述試驗(yàn)結(jié)果的可信性,即核糖體蛋白L2297KRTSAIN98氨基酸插入、23S rRNA A2662C、C1305A和T2560C突變與交叉耐藥分子機(jī)制有關(guān)。利用與木糖葡萄球菌同源性較高的金黃色葡萄球菌23S rRNA結(jié)構(gòu),通過(guò)DS 3.0中蛋白疊合模塊,構(gòu)建木糖葡萄球菌rRNA結(jié)構(gòu),包括23S rRNA和核糖體蛋白L3、L4和L22。進(jìn)而利用SYBYL對(duì)接程序?qū)��?gòu)建rRNA與泰樂(lè)菌素和氟苯尼考分別進(jìn)行分子對(duì)接,綜合Crash和Polar打分情況確定泰樂(lè)菌素與23S rRNA結(jié)構(gòu)中的核苷酸A2275、C2276、G2281、U2466和C2470形成了較強(qiáng)的氫鍵,氟苯尼考與23S rRNA結(jié)構(gòu)中的核苷酸A2275和G2095形成氫鍵,它們共同的結(jié)合位點(diǎn)是A2275。(7)核糖體蛋白L22 97KRTSAIN98氨基酸插入和23S rRNA C1305A與T2560C核苷酸突變調(diào)節(jié)耐藥蛋白表達(dá)是導(dǎo)致木糖葡萄球菌對(duì)泰樂(lè)菌素和氟苯尼考交叉耐藥機(jī)制之一。以木糖葡萄球菌rplV基因突變菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA A2662C基因突變菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA C1305A基因突變菌株以及木糖葡萄球菌23S rRNA T2560C基因突變菌株為研究對(duì)象,考察耐藥蛋白(核糖體蛋白L23、硫氧還蛋白、醛脫氫酶、伴侶蛋白和氯霉素耐藥蛋白)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,結(jié)果表明木糖葡萄球菌rplV基因突變菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA C1305A基因突變菌株以及木糖23S rRNA T2560C基因突變菌株中耐藥蛋白的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生差異性表達(dá)。然而,木糖23S rRNA A2662C基因突變菌株中耐藥蛋白的轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生差異性表達(dá)。綜上所述,木糖葡萄球菌對(duì)泰樂(lè)菌素和氟苯尼考交叉耐藥受多個(gè)機(jī)制調(diào)控,不僅與核糖體蛋白L22 97KRTSAIN98氨基酸插入和23S rRNA A2662C、C1305A和T2560C突變有關(guān),還與“轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白”即核糖體蛋白L23、“壓力應(yīng)激相關(guān)蛋白”即硫氧還蛋白、醛脫氫酶、伴侶蛋白以及氯霉素耐藥蛋白的差異表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S859.7
【圖文】：

抗菌藥物研發(fā)以及耐藥性發(fā)生時(shí)間軸（軸上方為抗菌藥物研發(fā)的時(shí)間為耐藥性產(chǎn)生的時(shí)間）[34]re 1-1 The timeline of antibiotic deployment (above) and the antibiotic resiobserved (below)[34]耐藥性已經(jīng)成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)界衛(wèi)生組織（WHO）針對(duì)耐藥性問(wèn)題發(fā)布一份報(bào)告即《抗微生物藥物測(cè)報(bào)告》，其中表明抗微生物藥物耐藥性現(xiàn)象是普遍存在的，不分國(guó)籍此，細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題已經(jīng)是一個(gè)全球性問(wèn)題。許多國(guó)家和國(guó)際組織的回應(yīng)并采取積極的措施。2016年9月，聯(lián)合國(guó)193個(gè)成員國(guó)簽署了一作掃除“超級(jí)病菌”對(duì)人類健康的威脅[40]。許多發(fā)達(dá)國(guó)家如美國(guó)、日本續(xù)建立細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，我國(guó)在2005年也展開(kāi)行動(dòng)[41]，包括獸用動(dòng)物源細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)。同時(shí)也在2016年8月印發(fā)了遏制細(xì)菌耐藥國(guó)20年）行動(dòng)的通知。源性細(xì)菌耐藥性已成為公共安全問(wèn)題

技術(shù)路線

將其作為下一代誘導(dǎo)的母菌，重復(fù)以上步驟，見(jiàn)圖2-1。對(duì)每一代誘導(dǎo)菌進(jìn)行菌株的 PCR 鑒定和 MIC 測(cè)定，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行-80 �！娲�。此外，為了考察上述獲得耐藥菌株的穩(wěn)定性，利用無(wú)泰樂(lè)菌素的 TSB 培養(yǎng)基對(duì)耐藥突變菌進(jìn)行連續(xù)傳10 代，依次取 0 代、2 代、4 代、6 代、8 代和 10 代的菌株進(jìn)行 MIC 測(cè)定。20
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本文編號(hào)：2883116