發(fā)布時(shí)間：2020-11-14 04:14

　　 為從分子遺傳學(xué)角度深入研究番鴨攻擊行為的發(fā)生原因,進(jìn)一步提高番鴨的福利水平,更好的服務(wù)于動(dòng)物健康安全的生產(chǎn),本試驗(yàn)應(yīng)用The Medial Recorder2.0軟件對(duì)選取的120只生長狀況良好的番鴨進(jìn)行為期1個(gè)月(每天24h)的行為觀察記錄,并采用瞬時(shí)觀察法和連續(xù)觀察法篩選出表現(xiàn)攻擊行為的番鴨(試驗(yàn)組Ⅰ)、被攻擊行為的番鴨(試驗(yàn)組Ⅱ)和未出現(xiàn)攻擊行為且表現(xiàn)正常的番鴨(對(duì)照組);利用Observer XT行為學(xué)軟件對(duì)選取的120只番鴨進(jìn)行行為定義并分析各個(gè)行為之間的差異和聯(lián)系。本試驗(yàn)采用Illumina HiSeq 2000高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、實(shí)驗(yàn)組Ⅱ和對(duì)照組三組番鴨(每組三次重復(fù))的下丘腦組織中的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選,利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)篩選的差異表基因進(jìn)行功能注釋,并進(jìn)行差異表達(dá)基因聚類分析,結(jié)果顯示:1.轉(zhuǎn)圈行為分別與爪抓、打斗、啄羽、啄肛和飲水行為呈顯著正相關(guān)(R=0.975,P0.05;R=0.973,P0.05;R=0.956,P0.05;R=0.968,P0.05;R=0.956,P0.05),與舒展行為呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.967,P0.05);爪抓行為與啄羽、啄肛和打斗行為呈極顯著正相關(guān)(R=0.995,P0.01;R=0.998,P0.01;R=0.994,P0.01),與舒展行為呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.961,P0.05)。其他修飾行為與警戒行為呈極顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.991,P0.01);警戒行為與打斗、啄羽和啄肛行為呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.961,P0.05;R=-0.985,P0.05;R=-0.957,P0.05),與躲避和抬頭行為呈顯著正相關(guān)(R=0.953,P0.05;R=0.954,P0.05);躲避行為與打斗和啄羽行為呈極顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.991,P0.01;R=-0.997,P0.01),與啄肛行為呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.951,P0.05);打斗行為與啄羽行為呈顯著正相關(guān)(R=0.956,P0.05);啄羽行為與啄肛行為呈極顯著正相關(guān)(R=0.998,P0.01),與飲水行為呈顯著正相關(guān)(R=0.955,P0.05);啄肛行為與飲水和抬頭行為呈顯著正相關(guān)(R=0.964,P0.05;R=0.965,P0.05)。飲水行為與采食行為呈極顯著正相關(guān)(R=0.990,P0.01),與吞咽呈顯著正相關(guān)(R=0.974,P0.05);采食行為與吞咽行為呈極顯著正相關(guān)(R=0.992,P0.01);點(diǎn)頭行為與低頭和張嘴呈顯著正相關(guān)(R=0.989,P0.05;R=0.951,P0.05)2.利用RNA-Seq技術(shù)篩選出攻擊、被攻擊和正常行為番鴨下丘腦組織中所有基因在行使生物學(xué)過程中所產(chǎn)生的SNPs、InDel位點(diǎn)和可變剪切事件,并發(fā)現(xiàn)它們?cè)谝陨先�組番鴨下丘腦組織的基因中,發(fā)生頻率不同。該事件的發(fā)生可能導(dǎo)致番鴨內(nèi)分泌失調(diào)以及出現(xiàn)啄羽、啄肛等異常行為。3.在攻擊組番鴨的下丘腦組織中,篩選出差異表達(dá)基因626個(gè),其中上調(diào)基因137個(gè),下調(diào)基因489個(gè);在被攻擊組番鴨的下丘腦組織中,篩選出差異表達(dá)基因649個(gè),其中上調(diào)基因232個(gè),下調(diào)基因417個(gè)。GO數(shù)據(jù)庫分析顯示,攻擊組差異表達(dá)基因主要涉及信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)和神經(jīng)調(diào)控等功能;被攻擊組差異表達(dá)基因主要涉及信號(hào)傳導(dǎo)、突觸前活躍區(qū)域和跨膜受體蛋白激酶活性等功能。KEGG數(shù)據(jù)庫分析顯示:攻擊組差異表達(dá)基因主要富集在代謝途徑、FoxO信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等7信號(hào)通路;被攻擊組差異表達(dá)基因主要富集在核糖體、內(nèi)吞作用、粘蛋白類型O-Glycan生物合成和ERBB信號(hào)通路等4個(gè)通路。3.通過對(duì)比攻擊和被攻擊兩組中差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集結(jié)果發(fā)現(xiàn),在攻擊組和被攻擊組的所有差異表達(dá)基因中,共有2個(gè)GO terms被共同顯著富集:行為和疼痛;在代謝途徑中,ERBB信號(hào)通路被共同顯著富集。對(duì)以上共同富集結(jié)果整合分析,篩選出75個(gè)番鴨攻擊行為關(guān)鍵候選基因。4.利用RNA-Seq技術(shù)篩選出的與番鴨攻擊行為相關(guān)的14個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)量與熒光定量PCR技術(shù)測(cè)得的結(jié)果基本一致。
【學(xué)位單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S834
【部分圖文】：

圖 3-1 cDNA 文庫構(gòu)建原理gure 3-1 The construction theory of cDNA lib量檢測(cè)織 cDNA 文庫構(gòu)建之后，使用 Qubit2.0 對(duì)其濃度被稀釋至 1ng/ul，然后使用 Agileninsert size）進(jìn)行精確檢測(cè)，確定 insert siz量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)）方法對(duì)文庫的nM,以確保構(gòu)建的 cDNA 文庫的質(zhì)量符合測(cè)iSeqTM2000 測(cè)序平臺(tái)對(duì)待檢測(cè)的番鴨下丘腦

因組定位分析，然后以 log2FC>1 或 log2FC<-1 且 FDR<0.05 為閾值進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，結(jié)合 GO 和 KEGG 數(shù)據(jù)庫對(duì)篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行后續(xù)的功能注釋及富集分析(LiuYZ et al,2016)。2.6 測(cè)序結(jié)果的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組篩選出的番鴨攻擊行為關(guān)聯(lián)候選基因中的 16 個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證（詳見第四章）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨機(jī)選取的 16個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組篩選出來的該基因的表達(dá)量基本一致，該試驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)可信，可進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序試驗(yàn)分析。2.7 測(cè)序數(shù)據(jù)分析流程本實(shí)驗(yàn)通過利用 RNA-Seq 技術(shù)對(duì)攻擊、被攻擊和正常三組行為的番鴨下丘腦進(jìn)行測(cè)序，將篩選出的所有基因序列與 NCBI 數(shù)據(jù)庫已公布的綠頭鴨的全基因組進(jìn)行比對(duì)，并通過圖 3-2 所示的流程對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息分析。

圖 3-3 測(cè)序錯(cuò)誤率分布圖Figure3-3Sequencing error rate distribution map3.1.2 A/T/C/G 堿基含量分布檢測(cè)在 Illumina 測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中，所用的 6bp 的隨機(jī)引物會(huì)使前幾個(gè)位置的核苷酸組成存在一定的優(yōu)勢(shì)，但這種優(yōu)勢(shì)會(huì)影響測(cè)序結(jié)果的均一性。理論上在普通文庫的構(gòu)建中，堿基 C 和 G 及 A 和 T 的含量在每個(gè)測(cè)序循環(huán)中應(yīng)分別相等且相對(duì)穩(wěn)定，而對(duì)于特異性文庫的構(gòu)建則會(huì)出現(xiàn) GC 分離的現(xiàn)象。在 Illumina測(cè)序的過程中，每個(gè) read 的前 6-7 個(gè)堿基會(huì)出現(xiàn)較大波動(dòng)，這屬于正�，F(xiàn)象。如圖 3-4 所示，攻擊、被攻擊和對(duì)照三組的測(cè)序讀長在 6 個(gè)堿基和 150 個(gè)堿基處，出現(xiàn) GC 堿基分離情況，其余位置的讀長均沒有出現(xiàn)堿基分離情況，且 GC含量都在 46％左右，表明測(cè)序的均一性程度高，滿足下一步測(cè)序要求
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2883060