發(fā)布時(shí)間：2020-11-11 06:44

　　 豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的以急性肺臟出血或慢性纖維素性胸膜粘連等為特征的一種呼吸道傳染性疾病。Apx外毒素是APP最重要的致病因子,且有ApxI、ApxII、ApxⅢ和ApxⅣ4種毒素因子,其中ApxⅠ可引起疾病出現(xiàn)肺部典型病變,也是引起豬傳染性胸膜肺炎的最強(qiáng)毒力因子,而ApxⅣ毒力相對(duì)較弱,但可由所有的APP分泌,且只有APP在動(dòng)物體內(nèi)時(shí)ApxⅣ才會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá),因此當(dāng)ApxI、ApxⅣ兩種毒素因子同時(shí)存在時(shí),則會(huì)對(duì)豬傳染性胸膜肺炎的診斷具有十分重要的臨床價(jià)值。通過(guò)提取豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ApxIA和ApxIVA基因組DNA,建立雙重PCR方法檢測(cè)并擴(kuò)增ApxIA和ApxIVA基因片段,并采用TA克隆技術(shù)獲得重組質(zhì)粒,然后進(jìn)行生物信息學(xué)分析目的基因片段特性并進(jìn)篩選,再進(jìn)一步的蛋白表達(dá)、純化及多克隆抗體制備。試驗(yàn)結(jié)果如下:1、成功建立了毒素ApxIA和ApxⅣA基因雙重PCR體系,ApxIA和ApxⅣA在DNA模板濃度為240μmol/L和150μmol/L、引物濃度為2ng/mL、Tm值55℃條件下可同時(shí)獲得兩條較亮目的條帶,且特異性和穩(wěn)定性檢測(cè)效果極佳。2、成功獲得了pMD18–ApxIA、pMD18–ApxIVA重組質(zhì)粒,通過(guò)基因生物信息學(xué)分析篩選出了基因片段長(zhǎng)度為1 209 bp的ApxIA和目的基因片段長(zhǎng)度為972bp的ApxⅣA的兩段蛋白表達(dá)強(qiáng)基因片段。與NCBI上的基因序列進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)相似度均有90%以上。3、獲得高效價(jià)的ApxIA和ApxⅣA多克隆抗體,經(jīng)ELISA檢測(cè)的效價(jià)分別可高達(dá)1:200000和1:50000;在此效價(jià)經(jīng)Western Blot檢測(cè)為陽(yáng)性。結(jié)論:成功建了ApxI A和ApxⅣA基因雙重PCR方法,其特異性、穩(wěn)定性較強(qiáng);獲得了ApxI A和ApxⅣA基因的多克隆抗體,效價(jià)分別可高達(dá)1:200000和1:50000,為今后豬傳染性胸膜肺炎的診斷防控提供了參考。
【學(xué)位單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

3.1 單重 PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）引物濃度變化對(duì)結(jié)果的影響從引物靈敏性檢測(cè)的結(jié)果（見(jiàn)圖2-1）顯示，ApxIA和ApxⅣA引物濃度在0.2ng/mL-2.0 ng/mL范圍內(nèi)都能檢測(cè)到目的片段。但隨著引物濃度增大，目的條帶越明亮，檢測(cè)結(jié)果越明顯。引物濃度為2.0 ng/mL目的條帶最為明顯。圖2-1 引物靈敏性檢測(cè).a：APXⅠA引物靈敏性檢測(cè); b：ApxⅣ A引物靈敏性檢測(cè); M：為DNA Maker 2000;1-10：引物濃度0.2ng/mL，0.4ng/mL，0.6ng/mL，0.8ng/mL，1.0ng/mL，1.2ng/mL

?pxIVA 基因雙重 PCR 方法的建立及多克隆抗體的制備16圖3 退火溫度的影響. a：退火溫度對(duì)APxⅠ A的影響; b：退火溫度對(duì)ApxⅣ A的影響；M ：DNA Maker 2000；1-6：退火溫度50℃-60℃Figure 2-3 Effect of Annealing Temperature.a:Effect of Annealing Temperature on APx I A;b:Effect of Annealing Temperature onApxⅣ A;M:DNA Maker 2000;1-6:Annealing Temperature 50℃-60℃3.2 雙重PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）引物濃度變化對(duì)結(jié)果的影響由圖2-4可知，在雙重PCR中，能擴(kuò)增ApxIA基因的引物的最低濃度為0.4μmol/L。隨引物濃度增加，目的片段的條帶越明顯。從圖2-4可以觀察到隨著ApxⅣA引物濃度增大，雖然ApxⅣ A目的條帶變得明亮，但ApxI A目的片段的條帶卻逐漸減弱直至消失。說(shuō)明在雙重PCR中，單個(gè)目的片段的擴(kuò)增數(shù)量與引物的濃度并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，還與另一引物的濃度有關(guān)。

第二章 試驗(yàn)研究17圖2-4 雙重PCR引物濃度變化對(duì)結(jié)果的影響.a：雙重PCR中ApxI A引物濃度變化對(duì)結(jié)果的影響; b：雙重PCR中ApxⅣA引物濃度變化對(duì)結(jié)果的影響；M：DNA Maker 2000; 1-10：ApxI A、ApxⅣA基因引物濃度0.2ng/mL，0.4ng/mL，0.6ng/mL，0.8ng/mL，1.0ng/mL，1.2ng/mL，1.4ng/mL，1.6ng/mL
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10 吳東;豬胸膜肺炎放線桿菌Apx Ⅱ抗原表位表達(dá)及間接ELISA方法建立與應(yīng)用[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

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