精原細胞瘤起源于原始生殖細胞，是睪丸最常見的惡性腫瘤，約占30％ ～40％ ，好發(fā)年齡為35～45歲? 。早期精原細胞瘤手術(shù)簡單，術(shù)后輔助以放療和化療，90％ 能痊愈，晚期發(fā)現(xiàn)則療效差，死亡率高。因此早期發(fā)現(xiàn)精原細胞瘤對提高患者的生存率、治愈率起著極其關(guān)鍵的作用。目前許多學者開始關(guān)注基因表達學方法來早期診斷精原細胞瘤，并研究精原細胞瘤相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)功能、表達與突變以及多基因之間的相互聯(lián)系，對于揭示精原細胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，探索臨床早期診斷的分子標記和治療靶點以及預后評價等都具有十分重要的意義。本文運用免疫組化S-P法和PCR．單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)法，以血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、p53基因來探索精原細胞瘤診斷和治療的新思路、新方法。

　　1 材料與方法

　　1．1 病例和標本38例精原細胞瘤病例選自1991至2007年外科手術(shù)根治標本，主要來自江蘇省人民醫(yī)院、延邊大學醫(yī)學院、江蘇省蘇北人民醫(yī)院和揚州市第一人民醫(yī)院存檔睪丸精原細胞瘤蠟塊。按照WHO(2004)睪丸腫瘤分類標準，經(jīng)揚州市病理診斷中心再次病理核實為精原細胞瘤。根據(jù)睪丸腫瘤臨床分期標準 將精原細胞瘤統(tǒng)一進行臨床分期，I期：腫瘤局限于睪丸，沒有腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況；1I期：腫瘤轉(zhuǎn)移至腹膜后淋巴結(jié)；111期：有膈上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，或淋巴結(jié)外轉(zhuǎn)移(肺，肝，腦，骨)。其中I期15例；II期11例，Ⅲ期12例。對照用正常睪丸組織10例，來自揚州大學醫(yī)學院病理教研室尸檢標本。

　　1．2 試劑和方法二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色試劑盒購自武漢博士德生物有限公司。采用免疫組化(S-P)法染色，所用一抗VEGF、p53及辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(streptavidin—peroxidase，SP)試劑盒均購自購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。按S-P試劑盒說明書操作。每批染色均設(shè)陰性空白對照(以PBS液代替一抗)。

　　p53引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。首先提取精原細胞瘤DNA進行PCR擴增，再配制2％的瓊脂糖凝膠，對p53基因5、6、7、8外顯子的PCR產(chǎn)物進行電泳，采用PCR．SSCP分析對組織標本進行p53基因突變的檢測和判斷。

　　1．3 結(jié)果判定高倍鏡下隨機觀察記數(shù)10個高倍視野(×200)中陽性細胞所占百分數(shù)，根據(jù)陽性細胞數(shù)和顯色強度分為：(一)，陽性細胞數(shù)小于5％或無陽性物質(zhì)的表達；(+)，陽性細胞數(shù)5％ ～25％或顯色淺；(++)，陽性細胞數(shù)25％ ～50％或顯色深；(+++)，陽性細胞數(shù)大于50％及顯色深。

　　1．4 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 10．0及EXCEL 2003軟件進行分析，組間比較選用x 檢驗，VEGF和p53表達的相關(guān)性分析選用Spearman等級相關(guān)比較，P<0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

　　2 結(jié) 果

　　2．1 VEGF在精原細胞瘤中的表。

　　2．2 p53陽性在精原細胞瘤中細胞的細胞核表達。

　　2．3 VEGF和p53的相關(guān)檢驗相關(guān)系數(shù)(r)=0．183(P>0．05)，VEGF和p53表達之間無相關(guān)。

　　2．4 p53在精原細胞瘤中突變的檢測結(jié)果選取11例精原細胞瘤標本，p53基因突變的有5例，突變率為45．45％ ，其中第5外顯子突變的有3例、第7外顯子突變的有1例、第8外顯子突變的有1例。

　　3 討論

　　3．1 精原細胞瘤中VEGF的表達 1989年Ferrara等 在體外培養(yǎng)的牛垂體細胞中分離出一種糖蛋白，它在體內(nèi)外都表現(xiàn)出特異性的促進血管內(nèi)皮細胞生長并誘導血管生成的作用，因此稱之為血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。VEGF在許多腫瘤中都有過表達的現(xiàn)象，國內(nèi)外許多報道表明，VEGF與精原細胞瘤之間關(guān)系密不可分。Restucci等 經(jīng)實驗得出在精原細胞瘤中，VEGF的表達以及微血管的密度遠遠高于正常組織，在轉(zhuǎn)移的精原細胞瘤中VEGF的表達和微血管的密度也高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的精原細胞瘤。

　　本實驗通過對精原細胞瘤臨床分期，檢測VEGF在精原細胞瘤各期中的表達情況顯示：I期與Ⅱ期、I期與Ⅲ期兩組間比較有顯著差異(P<0．05)，Ⅱ期與Ⅲ期之間比較無顯著差異(P>0．05)；精原細胞瘤與正常對照組織之間比較有顯著差異(P<0．01)。由此可見，VEGF隨著精原細胞瘤臨床分期的進展，陽性表達率也越來越高，雖然Ⅱ期與Ⅲ期之間比較無明顯差異，但仍然可以看到表達量的遞增趨勢。而正常睪丸組織中VEGF陽性的例數(shù)少，且表達量顯著低于腫瘤組織。此外本文亦發(fā)現(xiàn)VEGF在精原細胞瘤的腫瘤血管中大部分都表現(xiàn)出明顯陽性，提示VEGF在精原細胞瘤的發(fā)生和臨床進展中發(fā)揮著重要作用。由此推測，精原細胞瘤中腫瘤細胞的快速增殖在局部形成一個相對缺氧的微環(huán)境，缺氧反過來促進VEGF的分泌，進而促使腫瘤血管生成、微血管通透性增加，為腫瘤細胞進一步增殖提供營養(yǎng)基礎(chǔ)，筆耕論文新浪博客，從而形成一個惡性循環(huán)。由此不難得出：VEGF不僅反映了精原細胞瘤中血管的生成能力，而且與其惡性進展、侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，提示VEGF是一個良好的反映睪丸精原細胞瘤生物學行為的指標之一，如果能在精原細胞瘤發(fā)生的早期敲除VEGF基因，似乎可以明顯延緩甚至停止精原細胞瘤的發(fā)展，當然這種方法還需繼續(xù)研究。

　　3．2 精原細胞瘤中p53的表達和變異p53基因是研究最為廣泛深入的腫瘤相關(guān)基因，在50％ ～60％ 的人類各系統(tǒng)腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有p53基因的突變。p53被稱為“基因組衛(wèi)士”，其主要生物學功能是維持細胞基因組的穩(wěn)定，誘導細胞凋亡。

　　p53基因極其容易突變，Lewis等報道p53陽性表達在精原細胞瘤中為90％ ，在正常的睪丸組織中不表達，且在精原細胞瘤中p53隨著腫瘤的臨床分期增加而下降。Eid等¨ 報道p53基因在精原細胞瘤和胚胎性癌中陽性表達最強，p53表達在腫瘤臨床早期最高，到后期反而降低。

　　本實驗發(fā)現(xiàn)，p53在精原細胞瘤臨床分期I期中的表達率達到93．33％ ，1I期與Ⅲ期的表達率分別為54．55％和50％ 。與前人結(jié)果比較一致，證明p53在精原細胞瘤發(fā)生的早期起著非常重要的作用。由此推斷：精原細胞瘤在剛剛發(fā)生時，p53起著很重要的作用，隨著腫瘤細胞的進一步發(fā)展，p53的作用逐漸減弱，最后在精原細胞瘤的晚期僅起很微弱的作用，甚至起不到促進腫瘤發(fā)展的作用。因此可提示，監(jiān)測p53基因可以反映精原細胞瘤臨床早期的生物學行為，可用以早期發(fā)現(xiàn)精原細胞瘤，若早期敲除突變的p53基因或避免p53基因發(fā)生突變，似可為延緩精原細胞瘤的發(fā)展起到一定作用。

　　本實驗發(fā)現(xiàn)p53的5號外顯子有3例突變，7號有1例突變，8號有1例突變，p53基因突變率為45．45％ ；5例突變中有4例是處于臨床分期I期，1例處于Ⅱ期，說明從某種程度上可以認為p53在精原細胞瘤的早期容易發(fā)生突變，在精原細胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，p53在早期起較大作用。

　　3．3 精原細胞瘤中VEGF的表達與p53的關(guān)系關(guān)于精原細胞瘤中VEGF與p53相關(guān)性的研究較少，本實驗將VEGF與p53進行研究，發(fā)現(xiàn)兩者并無相關(guān)性，反而發(fā)現(xiàn)VEGF在精原細胞瘤的發(fā)展中呈遞增趨勢，而p53僅僅在精原細胞瘤的發(fā)生早期起作用。由此說明，與兩者相關(guān)的基因在精原細胞瘤中沒有明顯的協(xié)同作用，在精原細胞瘤中并不存在一條p53直接調(diào)節(jié)VEGF的通路，VEGF可能不受p53的直接調(diào)節(jié)。