發(fā)布時間：2020-11-20 06:10

　　 腦卒中、癲癇、腦腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等急慢性神經(jīng)損傷都被證明與N-甲基-D-門冬氨酸受體(NMDAR,NR)介導的神經(jīng)興奮毒性有關。通過選擇性干預NMDA受體過度激活所介導的神經(jīng)興奮毒性,為上述若干致死、致殘性疾患提供有效的防治手段是近20多年來基礎與臨床神經(jīng)科學始終追求的一個重要目標。然而,現(xiàn)有的NMDA受體拮抗劑或阻斷劑因嚴重的毒副作用和有限的臨床療效始終未能在臨床治療中取得成功。興奮毒性腦損害免疫防治策略在該領域是一項全新的探索:以NMDA受體為免疫原,對上述腦疾患高危人群予以自身免疫干預,打破自身免疫耐受,建立抗NMDA受體的特異性體液免疫反應,當誘導產(chǎn)生的自身抗體與NMDA受體結合后會干預其過度興奮,從而達到防治目的。由于過長的蛋白質抗原作為免疫原會對機體產(chǎn)生潛在的細胞毒性危害,因此構建抗原表位亞單位疫苗是最理想的選擇,而表位的選擇是疫苗設計的關鍵。為解決此問題,本課題對人NMDA受體主亞基NR1a膜蛋白的兩個胞外區(qū)片段——胞外氨基端和M3-M4環(huán)進行了分析,認為以M3-M4環(huán)作為免疫干預的靶點可能更為安全有效,并從中篩選出了一個自身免疫優(yōu)勢性表位,共聚焦顯微鏡下觀察到針對這個表位的單克隆抗體具有抗興奮毒性神經(jīng)保護效應。主要實驗內容如下: 一.人NR1a膜蛋白自身免疫優(yōu)勢性表位的生物信息學分析 通過對以往相關實驗資料的研究分析表明,在免疫干預過程中,NR1a膜蛋白的M3-M4環(huán)與胞外氨基端相比,可能更容易誘導產(chǎn)生安全有效的免疫反應。為避免以過長分子作為免疫原所導致的細胞毒性危害,在M3-M4環(huán)上篩選出一個自身免疫優(yōu)勢性表位,打破自身免疫耐受而實現(xiàn)安全、可控的免疫干預效果便成了問題的關鍵。近幾年生物信息學的飛速發(fā)展使異源分子B細胞表位的預測準確率有了很大提高,但對于自身分子,至今尚未有成熟的B細胞表位預測方法出現(xiàn)。本 WP=5 研究在對免疫原提呈途徑深入了解的基礎上,利用異源分子B細胞表位預測軟件GOLDKEY及相關的生物信息學分析數(shù)據(jù)庫,從B細胞表位、細胞毒性T細胞表位、輔助性T細胞表位、蛋白酶體剪切位點、內體/溶酶體蛋白酶剪切位點、糖基化位點、二級結構七個方面對自身分子進行自身免疫優(yōu)勢性表位的綜合分析。為驗證這套綜合預測方法的可靠性,我們對自身免疫優(yōu)勢性表位已知的40種自身免疫分子做了分析,結果顯示,這套方法的預測準確率達到70%以上,遠遠高于其他生物信息學表位預測方法的準確率。隨后我們用這套方法對人NR1a膜蛋白的M3-M4環(huán)進行分析,從中篩選出了一個自身免疫優(yōu)勢性表位R(22)LRNPS。 二.人NR1a膜蛋白自身免疫優(yōu)勢性表位單克隆抗體抗興奮毒性作用研究 Mab363是針對NR1a膜蛋白M3-M4環(huán)的特異性單克隆抗體,用mAb363篩選噬菌體展示隨機12肽庫得到的表位與本研究中用生物信息學方法確定的自身免疫優(yōu)勢性表位完全相符。為驗證用此表位進行自身免疫干預的安全有效性,本研究組做了體外神經(jīng)保護實驗,結果表明它的確具有明顯的抗谷氨酸興奮毒性作用。為進一步驗證此結論并探討mAb363神經(jīng)保護作用的機制,我們原代培養(yǎng)新生大鼠海馬神經(jīng)元,在培養(yǎng)第12天,用Ca2+熒光探針Fluo-3/AM標記細胞內游離Ca2+,并分別以mAb363及經(jīng)典的NMDA受體非競爭性拮抗劑MK-801預處理海馬神經(jīng)元,激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)下觀察二者對谷氨酸誘發(fā)細胞內Ca2+濃度([Ca2+]i)升高的影響。結果顯示,mAb363能顯著抑制谷氨酸所致海馬神經(jīng)元[Ca2+]i升高,此作用強于MK-801,且其本身對生理狀態(tài)下神經(jīng)元[Ca2+]i無影響。提示mAb363的抗興奮毒性作用是通過改變NMDA受體的蛋白質二級結構從而影響興奮毒性作用中的Ca2+內流實現(xiàn)的。 綜上所述,本研究首先選定人NR1a膜蛋白的M3-M4環(huán)作為自身免疫干預的靶片段,并建立了一套自身免疫優(yōu)勢性表位的生物信息學分析方法,經(jīng)驗證此方法具有較高的預測準確率后,對人NR1a膜蛋白M3-M4環(huán)靶片段進行了綜合分析判定,篩選出了其中的一個自身免疫優(yōu)勢性表位,并應用激光掃描共聚焦顯微鏡來觀察針對這個表位的單克隆抗體mAb363對谷氨酸誘導的細胞外Ca2+內流的影響,進一步證實了以此表位做免疫原進行自身免疫干預的安全有效性,同時對其抗興奮毒性機制進行了初步的探討,為下一步構建抗原表位亞單位疫苗提供了重要的理論和實驗基礎。
【學位單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
一、 論文
    （一） 中文摘要
    （二） 英文摘要
    （三） 前言
    （四） 第一部分
        材料
        方法
        結果
        討論
    （五） 第二部分
        材料
        方法
        結果
        討論
    （六） 結論
    （七） 參考文獻
二、 文獻綜述
    （一） 正文
    （二） 參考文獻
三、 致謝

【參考文獻】

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1 康曉楠,孫長凱,范明,宋占軍,趙杰,王吉慶,施廣霞;傅里葉變換紅外光譜分析NMDA受體單克隆抗體抗興奮毒損傷機理[J];生物化學與生物物理進展;2003年02期

2 孫長凱,黃遠桂,陳晉文,鞠躬,王多寧,賈鈾生,莫簡;紅藻氨酸誘導癲癇發(fā)作小鼠腦組織中 NO_2~- 與硫代巴比妥酸反應物濃度測定[J];中華神經(jīng)科雜志;1997年02期

3 孫長凱,趙杰,李伍舉,馮健男,劉淑紅,朱克,王吉慶,尹安民,韓大躍,張萬琴,姜潮,姜長斌,聶志余,王耀山,包禮平,范明;人N-甲基-D-門冬氨酸受體主亞基受體激活相關多肽的理化特性與抗原性分析[J];中華醫(yī)學雜志;2002年01期

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本文編號：2891066