發(fā)布時間：2020-11-20 07:12

　　 目的：以人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV-304為受試對象，觀察不同濃度的葡萄糖、胰島素和氧化型低密度脂蛋白對ECV-304細(xì)胞的協(xié)同損傷作用，建立一種糖尿病合并腦梗死的體外內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型；觀測滋陰益氣活血方左歸降糖靈提取液(ZGJTL)對該細(xì)胞損傷模型的調(diào)節(jié)作用。 方法：本實驗分前后兩部分。第一部分，取傳代的ECV-304細(xì)胞(第三至四代)，采用正交設(shè)計方法L9(3~4)，將生長融合狀的血管內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)分為9組，分別施加不同濃度的葡萄糖、胰島素和氧化型低密度脂蛋白條件液，培養(yǎng)24h后觀測指標(biāo)①光鏡觀察細(xì)胞一般形態(tài)學(xué)改變；②MTT法檢測細(xì)胞活性；③瓊脂糖凝膠電泳DNA ladder分析細(xì)胞凋亡情況；④透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)變化。綜合分析找出最佳協(xié)同損傷細(xì)胞模型。第二部分，在損傷細(xì)胞模型建立的基礎(chǔ)上，將其隨機(jī)分為5組，即模型組，低、中、高劑量的ZGJTL組和達(dá)美康組，另設(shè)一正常生長細(xì)胞組(不含牛血清的DMEM／F12液培養(yǎng)的空白組)，繼續(xù)培養(yǎng)48h后檢測指標(biāo)：①光鏡觀察細(xì)胞一般形態(tài)學(xué)改變；②MTT法檢測各組細(xì)胞活性；⑨透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；④測定細(xì)胞培養(yǎng)液中的tPA、PAI-1含量，NO、ET-1含量以及ICAM-1含量。 結(jié)果：①正交試驗表明20mmol／L葡萄糖，30mU／L胰島素加200mg／L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的混合條件液對細(xì)胞的損傷明顯(P＜0.05)，倒置顯微鏡下見細(xì)胞回縮變圓，輪廓分明，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)粗糙顆粒樣變化；透射電鏡亦觀察到該組細(xì)胞線粒體腫脹，嵴丟失，大多呈空泡變，多數(shù)細(xì)胞已呈凋亡或壞死樣改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)模糊，腫脹，呈小泡狀；MTT法檢測細(xì)胞活性，該組細(xì)胞活性顯著降低(P＜0.05)；瓊脂糖凝膠電泳見可凋亡細(xì)胞典型的階梯狀區(qū)帶電泳圖譜(DNA ladder)。 綜合分析認(rèn)為該組細(xì)胞是最佳的損傷模型。②倒置顯微鏡下可見，ZGJTL 中齊」量組比模型組的細(xì)胞形態(tài)總體上形態(tài)正常者居多，緊密排列的細(xì)胞 較模型組要多，圓縮形、輪廓增強(qiáng)的細(xì)胞較少，顆粒狀物也較少，與達(dá) 美康組比較無明顯差異。透射電鏡下觀測，中劑量的ZG JTL組可以減輕 細(xì)胞的損傷，見細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)線粒體結(jié)構(gòu)清晰，但仍有部分線粒體哈丟 失，成空泡狀，病變情況介于正常組與模型組之間。③MTT法測得各組 0D值，結(jié)果顯示:模型組較正常組細(xì)胞活力明顯下降(P0.似);中、 高劑量的ZGJTL和達(dá)美康均可以提高模型組的細(xì)胞活力，具有顯著性意 義(六0.05)，但達(dá)美康組和中、高劑量ZGJTL組之間比較細(xì)胞活力無 統(tǒng)計學(xué)差異(乃0.腸)。④檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的tPA、PAI一1含量，N0、 ET一1含量以及I以M一1，發(fā)現(xiàn)對照藥達(dá)美康可以促進(jìn)正常細(xì)胞以及模型 組細(xì)胞分泌tPA(P0.05)，其他各組tPA含量無顯著性差異;而 PAI 的含量各組差異較大，模型組較空白對照組顯著升高(六0.時)，低劑 量、中劑量和高劑量的ZGJTL均能顯著抑制這種升高趨勢(只0.以)， 達(dá)美康亦能顯著抑制這種升高趨勢(六0.01)，且達(dá)美康抑制程度顯著 高于低劑量，中劑量，高劑量的ZGJTL(分別為只0.01，只。:01，只0.05)。 模型組較空白對照組N0含量顯著降低(只0.05)，達(dá)美康和高劑量以 及中劑量的ZGJTL能夠顯著升高模型組的N0含量(均為只 0.01)，達(dá)美 康的這種升高N0含量的能力顯著大于中劑量的zc JTL(p0.時)，但 卻顯著地低于高劑量的ZGJTL;中、高、低劑量ZGJTL以及達(dá)美康均可 抑制模型組ET一l分泌增加(只0.05)，同時與達(dá)美康比較，中、低劑量 ZGJTL降低ET一1更顯著(六0.05)，而高劑量的ZGJTL組和達(dá)美康組之 間卻差異不顯著(外0.05);中劑量的ZGJTL和達(dá)美康可以逆轉(zhuǎn)模型組 較正常組的工CAM一1升高(只0.01)，而低劑量和高劑量的ZGJTL抑制 作用卻不顯著(與模型組比較，乃0.05)，中劑量的ZGJTL較達(dá)美康， 其抑制ICAM一1升高作用要優(yōu)(六0.01)。 結(jié)論:20 mmOI/L葡萄糖，3omU/L胰島素加2的mg/L熟化型低密 度脂蛋白的混合條件液對細(xì)胞的損傷明顯，可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞 死樣變化，且可出現(xiàn)促凝和抑制纖溶，以及介導(dǎo)細(xì)胞秘附等功能改變， 有利于血栓形成，在糖尿病血管并發(fā)癥特別是腦梗死的病理演變中可能 具有重要的意義;而ZGJTL和達(dá)美康均可不同程度的抑制這些病理改變， 且在不同的病理機(jī)制中ZGJTL和達(dá)美康所起到的作用各有強(qiáng)弱。33似 g/m1的達(dá)美康升高N0和降低ET一1的能力顯著強(qiáng)于20mg/ml zGJTL(中 劑量組)和10mg/ml ZGJTL(低劑量組)，而50fng/ml ZGJTL(高劑量組) 的作用卻比達(dá)美康強(qiáng);達(dá)美康以及低中高劑量的ZGJTL均可以降低以I 的分泌，比較而言，33”g/耐的達(dá)美康這種作用比三個劑量組的ZGJTL; 而達(dá)美康和不同劑量的ZGJTL對tPA的分泌均沒有顯著作用;在工以M一1 的千預(yù)中，33林g/ml的達(dá)美康和20mg/ml的ZGJTL均可以抑制ICAM一1 的分泌，而10mg/ml和50mg/m一的ZGJTL卻沒有這樣的功能，20mg/ml的 zGJTL這種抑制作用強(qiáng)于33，g/In1的達(dá)美康。
【學(xué)位單位】：湖南中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R363;R285
【文章目錄】：
縮略詞表
中文摘要
英文摘要
第一部分 葡萄糖、胰島素和低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的建立
    1 材料與方法
    2 結(jié)果
    3 分析與討論
第二部分 左歸降糖靈抗葡萄糖、胰島素和低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的調(diào)節(jié)作用
    1 材料與方法
    2 結(jié)果
    3 分析與討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄
    1 、 附圖
    2 、 綜述

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2891138