熱休克蛋白(HSPs,也稱為應(yīng)激蛋白)是一個高度保守的蛋白質(zhì)家族，廣泛分布于現(xiàn)知的所有活體組織內(nèi)。活細胞在生理情況下構(gòu)成性表達該類蛋白，當曝露于某些應(yīng)激狀況，如：熱休克、營養(yǎng)剝奪、病毒感染時，表達明顯增強。真核細胞內(nèi)的熱休克蛋白分子量從10kD～100kD大小不等，其中具有代表性的是HSP90、HSP70和HSP60。在生理情況下，熱休克蛋白與錯誤折疊／未折疊的蛋白質(zhì)相互作用，而參與其細胞內(nèi)的折疊、裝配和轉(zhuǎn)位，因而也被稱為“分子伴侶”蛋白或多肽鏈結(jié)合蛋白。 熱休克蛋白70(HSP70)家族是熱休克蛋白中最具代表性的一種，在進化過程中高度保守。不同來源的HSP70有相似的生化特征，研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌內(nèi)的HSP70與其真核細胞中類似物比較，其氨基酸組成有40％-50％的同源性，在核酸序列上則有50％-95％的同一性。哺乳動物細胞的 第四軍醫(yī)大學碩土學位論文 HSP70 家族成員中最具特色的主要有四種：（l）HSC70（heat shock cognate 70），為正常生理狀況下構(gòu)成性表達。（2）HSP70，在應(yīng)激情況下 大量表達。（3）Bip（或grp70），定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。（4）定位于細胞線粒體 基質(zhì)的 HSP70。不同的 HSP70在細胞內(nèi)行使不同的功能：（1）促進某些蛋 白質(zhì)至合適的位置進行折疊或裝配。（2）參與細胞內(nèi)多肽向細胞器的轉(zhuǎn) 位。（）參與靶向變性蛋白至溶酶體溶解。（4）溶解不溶性蛋白聚集 物。誘導型HSP70除具有與構(gòu)成性表達型相似的功能外，還具有一些與應(yīng) 激相關(guān)的功能，如：參與應(yīng)激情況下產(chǎn)生的變性蛋白聚集物的折疊和溶 解，及參與不可逆損傷蛋白的轉(zhuǎn)位而行使“分子伴侶”功能。 盡管人們對HSP70進行了廣泛的研究，對其作用機制仍然知之甚少。 現(xiàn)知HSP70有兩個結(jié)構(gòu)域：一個是氨基酸末端腺嘿吟核昔酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 另一個是竣基末端多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域。當有合適的蛋白底物，如：合成多肽 時，一些HSP70亞型可顯示出微弱的 ATP酶活性。多肽與 HSP70的結(jié)合需 要MP的參與，而當其與肝P結(jié)合時，可促進HSP70與多肽的解離。通過 這種核酸依賴性多肽結(jié)合和解離過程，可導致蛋白質(zhì)的正確折疊，HSP70的一 些其它功能可能也與此過程相關(guān)。 熱休克蛋白同時也是很多細菌和寄生蟲感染性疾病中的優(yōu)勢抗原。在 很多疾病，如：瘧疾、錐形蟲癥、美洲利什曼病、血吸蟲病、絲蟲病等患 者的血清中可檢測出HSP70抗體。另外，在一些寄生蟲感染和自身免疫性 疾病中還發(fā)現(xiàn)了針對HSP70家族成員的T細胞應(yīng)答反應(yīng)。 一些熱休克蛋白己經(jīng)成為免疫抑制藥的靶標，如：一種強效兔疫抑制 劑脫氧精肌菌素，顯示出明確的與HSC70結(jié)合活性。近年來，人們研究發(fā) 現(xiàn)，當一些多肽抗原與HSP70非共價結(jié)合時，HSP70可起到載體分子的作 用，而激起機體對該多肌的免疫反應(yīng)。另外，細胞在應(yīng)激狀態(tài)下誘導表達 HSP70，可激起機體產(chǎn)生針對相似或其它形式應(yīng)激的細胞保護作用。這種細 胞保護機制在缺血和神經(jīng)元損傷造成的組織損傷中研究比較深入。 為了進一步研究熱休克蛋白70的結(jié)構(gòu)和功能，及其在免疫應(yīng)答反應(yīng)和 細胞保護作用中的機制，我們克隆并原核表達了人熱休克蛋白 70（誘導 型）基因，并開發(fā)出一套純化該蛋白的方法。本研究包括三部分： （一）人HSP70基因的克隆與測序 從熱休克后的人肝癌細胞株SWC－ 7721中提取細胞總隊A，RT－PCR合成c0NA第一鏈，以其為模板PCR擴增 ·6· 第四軍醫(yī)大學碩士學位論文 一 HSP70 目的片段。擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳鑒定結(jié)果表明，從人肝 癌細胞株SWC－7721擴增得到了長度約1．gkb的DNA擴增片段。將該擴增 片段純化后行全基因的全自動序列分析。全基因的全自動序列分析結(jié)果與 GeneBank所報道的人HSP70基因序列相一致。 （二）人HSP70基因的原核表達 將測序鑒定后HSP70的基因片段經(jīng) ECORI和PStl雙酶切回收，并與經(jīng)同樣限制酶雙酶切的帶有T7啟動子的高 效原核表達質(zhì)粒叩－30相連接，建立原核表達載體叩－30HSP70，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌川109，將含有表達載體的菌落接種在LB培養(yǎng)基（含100。g幾氨節(jié) 青霉素）中培養(yǎng)，培養(yǎng)至A值約為0．4－0．6，37丫加誘導劑IPTG至終濃度 為lrnmol兒，并繼續(xù)培養(yǎng)Zh。4丫，以3，0009速度超速離心10。in收集細胞， 細胞裂解后經(jīng)SDS－PAGE檢測表達產(chǎn)物。結(jié)果顯示，重組pQE－30HSP70轉(zhuǎn)化 的大腸
【學位單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2002
【中圖分類】：R346
【文章目錄】：
縮略詞表
中文摘要
英文摘要
前言
文獻回顧
材料和試劑
實驗方法
試驗結(jié)果
討論
結(jié)論
參考文獻
致謝

【引證文獻】

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 王繼華;TGF-β1對UVA照射皮膚成纖維細胞保護作用的實驗研究[D];昆明醫(yī)學院;2008年

本文編號：2890146