發(fā)布時間：2020-11-16 13:58

　　 本研究中，將丙型肝炎病毒(HCV)基因組的5’非編碼區(qū)(5’UTR)插入到報告基因綠色熒光蛋白(eGFP)和熒光素酶(luciferase)的上游，并構(gòu)建基于真核細胞Ⅲ型啟動子的表達載體，這種載體能產(chǎn)生針對HCV5’UTR的小干擾RNA(siRNA)。然后將含有HCV 5’UTR的eGFP／luciferase和能產(chǎn)生小于擾RNA的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入Hela細胞，通過測定細胞發(fā)出的熒光和化學發(fā)光強弱來觀測抑制效果。實驗結(jié)果表明，與HCV 5’UTR特異性小干擾RNA表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的細胞無論從定性還是從定量上所測得的熒光和化學發(fā)光強度都明顯低于陰性對照，且細胞密度經(jīng)核染色與對照組無明顯區(qū)別。這揭示了小干擾RNA確實能引起HCV特異基因如5’UTR的沉默，且轉(zhuǎn)染進去的小干擾RNA表達質(zhì)粒對細胞沒有毒害作用。這一工作是通過載體直接在細胞內(nèi)表達小干擾RNA(siRNA)而不是化學合成的，可以使小干擾RNA在細胞內(nèi)得到穩(wěn)定表達，因此本研究設計的siRNA表達載體不僅可以有效沉默HCV 5’UTR，而且該系統(tǒng)可以靈敏地篩選更有效的針對HCV的siRNA，因而這一結(jié)果為研究利用RNA干擾進行基因治療HCV感染做了初步探索。
【學位單位】：武漢大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2003
【中圖分類】：R346
【文章目錄】：
Ⅰ 前言
    1.1 HCV基因組結(jié)構(gòu)及其蛋白功能
    1.2 HCV的生活特性
    1.3 當前主要的HCV體外細胞復制模型
    1.4 當前主要的HCV動物模型
    1.5 RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)
    1.6 RNA干擾的分子機制
    1.7 RNA干擾在抗人類惡性病毒方面的研究進展
Ⅱ 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 病人血清與細胞
        2.1.2 質(zhì)粒和菌株
        2.1.3 細菌與細胞培養(yǎng)所用溶液
        2.1.4 提取病毒RNA所用的試劑與溶液
        2.1.5 RT反應所用試劑
        2.1.6 其他反應所用試劑
        2.1.7 PCR產(chǎn)物的回收，克隆，鑒定所用試劑與溶液
        2.1.8 堿裂解法小量提質(zhì)粒試劑
    2.2 方法
        2.2.1 病毒RNA的提取
        2.2.2 RT反應
        2.2.3 引物設計與合成
        2.2.4 PCR反應
        2.2.5 PCR或酶切產(chǎn)物的回收
        2.2.6 PCR回收產(chǎn)物與pGEM-T載體法的連接與轉(zhuǎn)化
        2.2.7 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定
        2.2.8 EGFP-5’UTR的構(gòu)建
        2.2.9 pGL3／CMV與pGL3／CMV-5’UTR的構(gòu)建
        2.2.10 表達小干涉RNA載體pSilencer-5’UTR的構(gòu)建
        2.2.11 細胞培養(yǎng)
        2.2.12 DNA的轉(zhuǎn)染
        2.2.13 綠色熒光的觀察與熒光素酶活性的檢測
        2.2.14 細胞核的染色
Ⅲ 結(jié)果與分析
    3.1 從血清中HCV5’UTR的擴增與序列測定
    3.2 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定
    3.3 以HCV 5’UTR為前導序列的報告基因能夠正常表達
    3.4 針對5’UTR設計的小干擾RNA能特異性地抑制含有5’UTR的報告基因的表達
Ⅳ 討論
研究總結(jié)
參考文獻
附錄
致謝

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 畢勝利,白憲鶴,叢勉爾,田厚文,孫得貴,H.S.Margolis,劉崇柏;中國人丙型肝炎病毒基因組的一級結(jié)構(gòu)及其變異[J];病毒學報;1993年02期

本文編號：2886311