發(fā)布時(shí)間：2020-11-13 10:15

　　 戊型肝炎(hepatitis E, HE)是繼甲型肝炎外另一種經(jīng)腸道傳播的嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的病毒性肝炎。戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)是其病原體,為單股正鏈RNA病毒。明確HEV的基因型對(duì)于戊型肝炎的診斷、預(yù)防及流行病學(xué)具有重要意義。 目前,HEV基因分型尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),存在很多問(wèn)題與分歧。由于全基因組測(cè)序費(fèi)時(shí)費(fèi)力,大多數(shù)研究者通過(guò)測(cè)定HEV基因組部分序列進(jìn)行基因分型,而用于分型的基因組區(qū)段至今還未達(dá)成統(tǒng)一,給各HEV基因分型研究結(jié)果的比較造成很大困難。其次,HEV基因分型采用的標(biāo)準(zhǔn)不盡相同。部分學(xué)者以核苷酸同源性低于20%為標(biāo)準(zhǔn),而有些以15%為標(biāo)準(zhǔn),還有部分學(xué)者以遺傳距離作為基因分型標(biāo)準(zhǔn)。隨著更多的HEV毒株的分離測(cè)序,標(biāo)準(zhǔn)的不確定性嚴(yán)重影響了HEV的基因分型結(jié)果,尤其基因亞型的判別更為困難。此外,HEV基因分型的命名方法也存在混亂之處,羅馬數(shù)字與阿拉伯?dāng)?shù)字混用,同一分離株被命名為不同基因型。 針對(duì)HEV基因分型的現(xiàn)狀,本研究通過(guò)設(shè)計(jì)通用性引物,嘗試?yán)�用逆轉(zhuǎn)錄-巢式聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增各基因型HEV基因組部分序列,并與文獻(xiàn)已報(bào)道的通用性引物擴(kuò)增的PCR片段比較,篩選最適的HEV基因組區(qū)段以替代全序列進(jìn)行HEV基因分型,從而統(tǒng)一用于HEV基因分型的基因組區(qū)段。同時(shí)利用全基因序列計(jì)算所得數(shù)據(jù),建立用于HEV基因分型的基因同源性及遺傳距離的標(biāo)準(zhǔn),并在基因分型的同時(shí)提出統(tǒng)一的命名規(guī)則,使HEV基因分型進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化。本研究實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下兩部分: 基于不同基因組區(qū)段進(jìn)行HEV基因分型 根據(jù)GenBank中已登錄的37株不同基因型HEV全序列,在HEV序列保守區(qū)設(shè)計(jì)MJ-A、MJ-B、MJ-C、MJ-D 4組引物,同時(shí)檢索文獻(xiàn)找出其它已有報(bào)道的20組通用性引物。通過(guò)兩因素及單因素統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,分析基于24組引物擴(kuò)增區(qū)段的基因同源性和遺傳距離數(shù)據(jù)與基于全序列的數(shù)據(jù)在不同基因型及同一基因型內(nèi)有無(wú)差異,找出與全序列無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的區(qū)段;比較基于該區(qū)段及基于基因組全序列進(jìn)行的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果,進(jìn)一步證明該區(qū)段可替代全序列用于基因分型。依據(jù)全序列計(jì)算所得的遺傳距離、基因同源性,建立HEV的分型標(biāo)準(zhǔn),以系統(tǒng)進(jìn)化分析驗(yàn)證。 研究結(jié)果表明,以基因同源性為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),利用Dunnett-t及SNK-q兩種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,在兩因素及單因素方差分析中,僅有位于HEV RNA多聚酶功能域的MJ-C組引物PCR擴(kuò)增區(qū)段與全序列分析數(shù)據(jù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可在不同基因型間及同一基因型內(nèi)均可替代全序列進(jìn)行基因分型;以遺傳距離為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),引物GV-A擴(kuò)增區(qū)段可替代全序列進(jìn)行基因分型,但無(wú)法替代I型內(nèi)部HEV的分型。 以37株全基因組HEV統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為參照,現(xiàn)有HEV基因型及亞型分型標(biāo)準(zhǔn)分別為:基因型間遺傳距離大于0.30,核苷酸差異大于24%;基因亞型間遺傳距離大于0.11,核苷酸差異大于10%。按照這一標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化分析,37株HEV分為I~IV基因型及若干亞型�；�于MJ-C擴(kuò)增區(qū)段的基因分型結(jié)果與全序列分型完全一致。 二、通用性引物RT-PCR擴(kuò)增不同基因型HEV 用篩選得到的最適引物MJ-C進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增I~IV型HEV標(biāo)準(zhǔn)株,檢測(cè)其通用性,并用于HEV IgM陽(yáng)性的臨床標(biāo)本RT-PCR檢測(cè)及基因分型。 結(jié)果顯示MJ-C可以擴(kuò)增各型HEV標(biāo)準(zhǔn)株;38份臨床標(biāo)本,13份測(cè)出特異性HEV RNA,陽(yáng)性率35%。13份樣本均為IV型HEV,進(jìn)一步可分為4種基因亞型。 WP=5 綜上,本研究通過(guò)生物信息學(xué)及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析,成功篩選出位于HEV RNA多聚酶功能域的基因組區(qū)段(4254~4560nt)可以替代HEV基因組全序列進(jìn)行基因分型,該區(qū)段側(cè)翼序列保守,可用于擴(kuò)增不同基因型HEV;同時(shí)基于全基因組序列分析,建立HEV基因分型標(biāo)準(zhǔn)為基因型間遺傳距離大于0.30,核苷酸差異大于24%;基因亞型間遺傳距離大于0.11,核苷酸差異大于10%;此外,本研究首次明確提出HEV基因型的系統(tǒng)命名法:以羅馬數(shù)字和26個(gè)英文小寫(xiě)字母分別作為基因型及基因亞型序號(hào),以毒株分離時(shí)間先后作為命名順序。上述標(biāo)準(zhǔn)的建立,必將解決HEV基因分型中的眾多分歧,進(jìn)一步完善與促進(jìn)HEV基因分型的研究。
【學(xué)位單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類(lèi)】：R373.2
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
縮略詞表
目錄
前言
文獻(xiàn)綜述
第一章
    材料與方法
    結(jié)果
    分析與討論
第二章
    材料與方法
    結(jié)果
    分析與討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介
后記

【引證文獻(xiàn)】

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1 郝寶成;蘭喜;刑小勇;項(xiàng)海濤;胡永浩;柳紀(jì)省;梁劍平;;豬戊型肝炎病毒分子生物學(xué)與流行病學(xué)研究進(jìn)展[J];中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào);2010年05期

本文編號(hào)：2882079