免疫印跡法(Western blot)是一種半定量分析生物組織蛋白質(zhì)表達(dá)的比較常見(jiàn)的方法，也稱做酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法(Enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB)，因其與Southern首先建立的檢測(cè)核酸印跡的方法Southernblot相似，所以也被稱為Western—blot。它是一種將高分辨凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)結(jié)合起來(lái)的雜交技術(shù)。其特點(diǎn)為分析量大、靈敏度高、特異性強(qiáng)等，是檢測(cè)蛋白質(zhì)特性表達(dá)及分布的常用方法，主要分3個(gè)階段進(jìn)行，但由于該檢測(cè)方法步驟較繁瑣，實(shí)驗(yàn)變量較多，結(jié)果不穩(wěn)定等特性，使得應(yīng)用該法測(cè)定組織中的蛋白濃度時(shí)常常會(huì)遇到困難，花費(fèi)大量的人力物力財(cái)力和時(shí)間去摸索實(shí)驗(yàn)條件。其中，總蛋白的上樣量直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可參照性以及后續(xù)步驟的反應(yīng)靈敏度。目前，關(guān)于人血清總蛋白上樣量的參考范圍罕見(jiàn)報(bào)道，為此，本研究將探討人血清總蛋白上樣量的不同對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

　　1 材料與方法

　　1．1 材料：正常成年人新鮮血清標(biāo)本(均采自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢科)，預(yù)染色標(biāo)志蛋白質(zhì)26618(美國(guó)Ther—mo公司)。

　　1．2 溶液：PBS緩沖液(20×)(購(gòu)自生工生物)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，SD PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)，SDSPAGE凝膠配制試劑盒，sD PAGE電泳液，考馬斯亮藍(lán)染色液，考馬斯亮藍(lán)染色脫色液(均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所)。

　　1．3 儀器：E1x800自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio—Tek Instruments公司)，96孔板(碧云天生物技術(shù)研究所)，制膠器(美國(guó)Bio—Rad公司)，電泳儀(美國(guó)Bio—Rad公司)，雙向電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio Rad公司)。

　　1．4 方法

　　1．4．1 BCA法測(cè)定樣本血清總蛋白濃度。

　　1．4．2 標(biāo)本處理：將正常成人新鮮血清分裝，用1×PBS緩沖液分別將血清稀釋2倍、5倍、1O倍及2O倍，按4：1加入SDS—PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)，沸水悶煮3 min，10 000r／min離心3 min，常溫預(yù)冷。

　　1．4．3 制膠：常規(guī)方法配置5 濃縮膠以及6 分離膠，膠厚1．0 mm 。

　　1．4．4 上樣：等體積上樣，每孔上樣5L。

　　1．4．5 電泳：恒壓電泳，濃縮膠80 mV，分離膠120 mV。

　　1．4．6 染膠：將膠取出置于水平搖床上緩慢搖動(dòng)，用考馬斯亮藍(lán)染色液染色2 h。

　　1．4．7 脫色：倒出染色液，置于水平搖床上緩慢搖動(dòng)，用考馬斯亮藍(lán)染色脫色液脫色過(guò)夜，期間更換脫色液3次，直至藍(lán)色背景全部被脫去。

　　1．4．8 拍照：倒出脫色液，用雙蒸水洗滌，置于雙向電泳系統(tǒng)中，拍照。

　　1．5 實(shí)驗(yàn)條件控制：嚴(yán)格地控制實(shí)驗(yàn)條件，其中包括：采用比較準(zhǔn)確的BCA法測(cè)定總蛋白濃度，且多次測(cè)量求平均值；溶液配制采用去離子水，膠體的配制采用純水；相同條件電泳至少重復(fù)試驗(yàn)3次；所有操作步驟所使用到的儀器均為同一套裝置；所有使用到的溶液均為一次性使用，且現(xiàn)用現(xiàn)配。

　　2 結(jié) 果

　　2．1 樣本血清總蛋白濃度測(cè)量3次，分別為5O．11，5O．04，49．88 g／L。平均蛋白濃度5O．01 g／L。

　　2．2 稀釋不同倍數(shù)的正常成年人血清總蛋白等體積上樣后的電泳結(jié)果，見(jiàn)圖1。圖1顯示，血清總蛋白上樣量的不同直接影響到目的條帶的可辨識(shí)度：以原血清(50．01 g／L)上樣5“L其中含SDSPAGE蛋白上樣緩沖液(5×)1 L，下同，上樣總蛋白量200g，電泳所得條帶拖帶現(xiàn)象嚴(yán)重，在不同分子量處沒(méi)有明顯的單一蛋白條帶顯現(xiàn)，無(wú)法辨識(shí)目的蛋白條帶，影響后續(xù)分析；以2倍稀釋血清(25．00 g／L)上樣，上樣總蛋白量100／xg，拖帶現(xiàn)象仍然存在，但已隱約可見(jiàn)若干蛋白條帶顯現(xiàn)，似稍有彎曲變形；以5倍稀釋血清(10．00 g／L)上樣 ，上樣總蛋白量4O g，電泳后可見(jiàn)蛋白條帶清晰，邊緣規(guī)整無(wú)形變；以1O倍稀釋血清(5．00 g／L)上樣5gI ，上樣總蛋白2O g，電泳后蛋白條帶清晰；以2O倍稀釋血清(2．5Og／L)上樣5／L，上樣總蛋白1O g，電泳所呈現(xiàn)條帶顏色較淺，提示蛋白總量不足，影響后續(xù)定量分析的靈敏度。

　　3 討 論

　　Western blot是一種分析生物組織蛋白質(zhì)表達(dá)比較常見(jiàn)的方法，常常作為篩選出的差異蛋白的后續(xù)驗(yàn)證工作。

　　我們針對(duì)實(shí)驗(yàn)條件階段比較重要的影響因素，即人血清總蛋白不同的上樣量進(jìn)行研究，比較不同的上樣量產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示：當(dāng)上樣的總蛋白量大于100 g時(shí)，SDSPAGE凝膠不能很好的區(qū)分不同分子量的蛋白質(zhì)，分離效率下降，影響后續(xù)分析操作的進(jìn)行；當(dāng)上樣的總蛋白量在2o～100 g之間時(shí)，分離出的各分子量蛋白質(zhì)條帶清晰，此時(shí)分離效率較高；當(dāng)上樣的總蛋白量在l0 g及其以下時(shí)，分離出的各分子量蛋白質(zhì)條帶顏色較淺，提示蛋白總量過(guò)低，不利于后續(xù)分析步驟的進(jìn)行，筆耕論文新浪博客，降低了測(cè)試靈敏度。所以，大多有關(guān)Western blot的實(shí)驗(yàn)都選用2O～ 100 g這一總蛋白上樣量來(lái)進(jìn)行研究，提示總蛋白上樣量直接關(guān)系著實(shí)驗(yàn)的成功與否，與所研究的蛋白種類和組織來(lái)源并無(wú)直接聯(lián)系。

　　因此，本實(shí)驗(yàn)較好的闡明了Western blot中總蛋白上樣量的大小與后續(xù)實(shí)驗(yàn)的關(guān)系，為今后同類實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展提供了參考。

　　6 SDS-PAGE凝膠最佳分離范圍是分子量在5O～150 ku的蛋白質(zhì)。本次試驗(yàn)中，筆者選擇6 的SDS-PAGE凝膠用以分離人血清蛋白質(zhì)主要是考慮人血清中5O～ 150ku的蛋白質(zhì)相對(duì)其他分子量區(qū)間較少，可以較清楚的顯示出由于上樣量不同而導(dǎo)致的不同結(jié)果，不會(huì)因條帶過(guò)多影響結(jié)果的觀察。

　　本次試驗(yàn)作者將電泳時(shí)的電壓固定為濃縮膠8O mV、分離膠120 mV，主要是考慮選取5O～150 ku中間的100 ku分子量蛋白質(zhì)的參考電壓進(jìn)行跑膠，以利于人血清中各蛋白質(zhì)組分的分離。