研究背景及意義結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma, CRC)是一種人類常見的惡性腫瘤,是在內(nèi)、外因素影響下發(fā)生的多基因表達(dá)失調(diào)的一種個(gè)體化疾病,嚴(yán)重威脅著人類生命健康。從分子水平解釋結(jié)直腸癌,有助于闡釋這種高發(fā)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制,為其早期診斷提供基因檢測(cè)工具,為從分子水平的定向治療提供前瞻標(biāo)志物,其中一些高頻突變和一些常見信號(hào)通路有可能成為治療結(jié)直腸癌的靶點(diǎn)。蛋白質(zhì)的泛素化修飾是人體內(nèi)非常重要的一種翻譯后的修飾方式,該修飾可以與被修飾蛋白的穩(wěn)定性和功能活性狀態(tài)有關(guān)。它可以有效調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和免疫炎癥反應(yīng)等病理生理過程。其中E3連接酶是泛素蛋白酶中種類最多的一種,目前認(rèn)為泛素系統(tǒng)不僅僅是細(xì)胞中蛋白質(zhì)的重要降解系統(tǒng),它能通過調(diào)控底物蛋白質(zhì)的活性,參與調(diào)節(jié)多種重要的生命過程的發(fā)生和發(fā)展,泛素系統(tǒng)的異常與機(jī)體的炎癥性疾病、腫瘤等有很大的關(guān)系。神經(jīng)調(diào)節(jié)素受體降解蛋白1(NrdP1)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種泛素E3連接酶,它不僅能調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和免疫炎癥反應(yīng)等病理生理過程,而且有研究顯示NrdP1能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。目前,在大腸癌中Nrdp1已經(jīng)被證明能夠通過下調(diào)p27表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。然而,Nrdp1是否能夠調(diào)節(jié)大腸癌細(xì)胞的侵襲能力至今尚未明確。本研究致力于Nrdp1在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲中的作用及機(jī)理研究。體外研究中我們通過RT-PCR、Western blotting的方法研究了結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞中Nrdp1和MMP7之間的關(guān)系,進(jìn)一步通過siRNA敲除Nrdp1、MMP7在Caco-2細(xì)胞中的表達(dá)研究了Nrdp1在腫瘤侵襲中的作用并探討具體作用機(jī)制。Western blotting方法檢測(cè)結(jié)腸癌組織中Nrdp1及相關(guān)分子的表達(dá)并分析研究。最終,我們首次闡明了Nrdp1可能通過抑制EGFR下游信號(hào)通路中的ERK/MAPK通路來(lái)抑制MMP7在大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)和在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲中的作用。本研究為更好的理解Nrdp1在腫瘤中的作用提供了新的理論依據(jù)。目的對(duì)大腸癌患者結(jié)腸癌組織(CR)和癌旁組織(NT)中Nrdp1及MMP7的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行分析；探討Nrdp1對(duì)MMP7的影響及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的作用。方法收集20例組織標(biāo)本(結(jié)直腸癌組織和配對(duì)的癌旁正常組織),所有的組織標(biāo)本均來(lái)源于是山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院2008年～2014年間病理及臨床診斷為結(jié)直腸癌的患者。Western Blotting方法檢測(cè)20例大腸癌患者結(jié)腸癌組織(CR)和癌旁組織(NT)中Nrdp1及MMP7的表達(dá)情況；結(jié)直腸癌組織Nrdp1與MMP7表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析；在人結(jié)直腸癌細(xì)胞系Caco-2的基礎(chǔ)上,通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法構(gòu)建了過度表達(dá)Nrdp1 (Caco-2-nrdp1)的細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Caco-2細(xì)胞(Caco-2null)作為對(duì)照,同時(shí)采用Nrdp1siRNA轉(zhuǎn)染caco-2細(xì)胞作為抑制Nrdp1表達(dá)(Caco-2-shndpl)的細(xì)胞系,分析不同Nrdp1表達(dá)水平人結(jié)直腸癌細(xì)胞系caco-2中MMP7的表達(dá)情況,同時(shí)采用Western Blotting方法進(jìn)一步驗(yàn)證不同Nrdp1表達(dá)水平人結(jié)直腸癌細(xì)胞系caco-2中MMP7的表達(dá)情況；為了繼續(xù)研究Nrdp1是否影響MMP7在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲中的作用,我們首先將MMP7siRNA和Ncontrol siRNA轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞并分別命名為MMP7si-Caco-2和NCsi-Caco-2細(xì)胞,檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后用Real Time PCR及Western blotting分別檢測(cè)MMP7mRNA水平、蛋白水平的敲低效果；比較聯(lián)合敲低Nrdp1/MMP7與單獨(dú)敲低MMP7之后的MMP7表達(dá)水平；比較聯(lián)合敲低Nrdp1/MMP7與單獨(dú)敲低MMP7之后的細(xì)胞侵襲能力；比較不同Nrdp1表達(dá)水平人結(jié)直腸癌細(xì)胞系caco-2侵襲能力；對(duì)Nrdp1抑制MMP7在大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)和在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲中的作用的信號(hào)通路進(jìn)行篩選；比較聯(lián)合敲低Nrdp1/MMP7與單獨(dú)敲低MMP7之后的細(xì)胞增殖能力；比較聯(lián)合敲低Nrdp1/MMP7與單獨(dú)敲低MMP7之后的細(xì)胞凋亡比例。結(jié)果結(jié)直腸癌中Nrdp1的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P0.05), MMP7的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P0.05)；Nrdp1及MMP7的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)相關(guān)(r=-0.82,P0.001)。Caco-2-nrdp1細(xì)胞中Nrdp1表達(dá)升高,Caco-2-shnrdp1細(xì)胞中Nrdp1表達(dá)顯著下降(P0.05)。同時(shí)我們的研究發(fā)現(xiàn),在Caco-2-nrdpl細(xì)胞中MMP7的表達(dá)水平顯著下降,而caco-2-shnrdp1細(xì)胞中MMP7的水平顯著升高(P0.05),同時(shí)Western Blotting也驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果。MMP7siRNA轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞后,MMP7的表達(dá)被有效下調(diào)了。Caco-2細(xì)胞中敲低Nrdpl之后MMP7水平明顯升高,聯(lián)合敲低Nrdp1/ MMP7之后MMP7水平較單獨(dú)敲低MMP7明顯升高(P0.05)。Ncontrol siRNA和MMP7 siRNA作用Caco-2細(xì)胞后穿膜的平均細(xì)胞數(shù)分別為252.67±14.16個(gè)和56.00±5.00個(gè),Nrdp1/MMP7 siRNA聯(lián)合作用Caco-2細(xì)胞后穿膜的平均細(xì)胞數(shù)為156.00±10.00個(gè),提示Caco-2細(xì)胞中敲低MMP7后細(xì)胞侵襲能力明顯下降,聯(lián)合敲低Nrdp1/MMP7后細(xì)胞侵襲能力較單獨(dú)敲低MMP7明顯上升,表明Nrdpl抑制了MMP7在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲中的作用。Caco-2-Nrdp1、Caco-2null、Caco-2-shNrdp1作用Caco-2細(xì)胞后穿膜的平均細(xì)胞數(shù)分別為89.60±12.10個(gè)、152.00±8.00個(gè)和589.00±12.00個(gè)；在Caco-2-shNrdp1細(xì)胞中抑制MMP7的表達(dá), Caco-2-shNrdp1-shMMP7作用Caco-2細(xì)胞后穿膜的平均細(xì)胞數(shù)為126.40±4.35個(gè),表明Caco-2-Nrdp1細(xì)胞的侵襲能力最弱,caco-2-shNrdp1細(xì)胞的侵襲能力最強(qiáng)；在Caco-2-shNrdp1細(xì)胞中抑制MMP7的表達(dá),caco-2-shNrdp1的侵襲能力降低。PD98059沒有影響Nrdp1的表達(dá)水平,但抑制了MMP7的表達(dá)水平(P0.05),導(dǎo)致了細(xì)胞侵襲力的顯著下降(P0.05),提示Nrdp1可能通過抑制ERK / MAPK通路抑制MMP7的表達(dá)。Caco-2細(xì)胞中敲低MMP7后細(xì)胞增殖能力明顯下降,聯(lián)合敲低Nrdp1/MMP7之后細(xì)胞增殖能力較單獨(dú)敲低MMP7明顯降低。Ncsi-Caco-2細(xì)胞、MMP7si-Caco-2細(xì)胞和Nrdp1/MMP7si-Caco-2調(diào)亡比例分別為0.8%、1.6%和1.9%,由于對(duì)照組細(xì)胞的調(diào)亡比例很低,我們分析Caco-2細(xì)胞處在增殖期,不在調(diào)亡期,因此敲低MMP7與聯(lián)合敲低Nrdp1/MMP7可能不影響細(xì)胞的調(diào)亡。結(jié)論1.在結(jié)直腸癌組織中Nrdp1的表達(dá)下降,MMP7的表達(dá)升高,兩者呈負(fù)相關(guān)；2.結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2中聯(lián)合敲除Nrdp1/MMP7之后細(xì)胞侵襲能力較單獨(dú)敲低MMP7明顯升高；繁殖能力降低；而對(duì)細(xì)胞凋亡的影響不大；Caco-2-nrdp1細(xì)胞的侵襲能力最弱,Caco-2-shnrdp1細(xì)胞的侵襲能力最強(qiáng),同時(shí)在Caco-2-shnrdp1細(xì)胞中抑制MMP7的表達(dá),Caco-2-shnrdp1的侵襲能力降低,說(shuō)明Nrdp1抑制MMP7在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲中的作用；3. Nrdp1可能通過抑制EGFR下游信號(hào)通路中的ERK/MAPK通路來(lái)抑制MMP7在大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)。綜上所述,本研究證實(shí)了Nrdp1/MMP7新通路可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力,表明Nrdp1在腫瘤細(xì)胞中有多種功能,因此本研究豐富了Nrdp1通過泛素化某些蛋白調(diào)控某些細(xì)胞功能,為腫瘤分子生物學(xué)研究提供了新的方向。

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.34
【目錄】：

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【共引文獻(xiàn)】

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