研究背景：近年來我國飲酒人群的數(shù)量以及酒精消費數(shù)量逐年增加,因飲酒引起的消化系統(tǒng)疾病,已經(jīng)成為一個嚴重的社會問題與醫(yī)學問題。飲酒導致的消化系統(tǒng)疾病多為胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、酒精性肝病、肝硬化等；長期飲酒還可以誘發(fā)腸上皮化生,腸上皮化生是胃粘膜病變向胃癌過度的一個階段。藥對研究是中藥復方研究的重要組成部分,也是研究中藥復方的一個突破口。黃芪—葛根藥對首見于清代醫(yī)書《證治匯補》中所記載的黃芪葛根湯,原方中黃芪與葛根的配伍比例為2：1,歷代多位醫(yī)家認為此方具有解酒毒的作用。前期動物實驗研究發(fā)現(xiàn),黃芪苷類可以減輕乙醇對胃粘膜的損傷。黃芪甲苷與黃芪總苷可以促進已損傷的胃上皮細胞GES-1的修復,其作用機制與黃芪甲苷、黃芪總苷參與細胞凋亡等相關(guān)通路有密切聯(lián)系。因此本研究以黃芪—葛根藥對為切入點,探討其保護胃粘膜損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)與相關(guān)機制。目的：優(yōu)選黃芪—葛根藥對保護胃粘膜損傷的最佳水煎工藝；建立黃芪—葛根藥對不同配伍比例的高效液相指紋圖譜,通過譜效關(guān)系的研究,明確黃芪—葛根藥對中的異黃酮類成分對保護胃粘膜損傷的貢獻大��；初步探討黃芪—葛根藥對保護乙醇誘導胃粘膜損傷的機制。方法：1.正交試驗結(jié)合藥效學實驗優(yōu)選黃芪—葛根藥對抗乙醇誘導胃粘膜損傷最佳水煎工藝。以黃芪—葛根藥對水煎液中葛根素的化學含量作為評價指標,以乙醇對小鼠胃粘膜損傷分數(shù)作為藥效指標,設(shè)計正交試驗,對藥對煎藥的時間、煎藥的次數(shù)、煎藥水量3個因素,分別分為3個水平進行綜合考察,優(yōu)選出黃芪—葛根藥對(2：1配伍)保護胃粘膜的最佳水煎工藝。2.高效液相色譜法建立黃芪—葛根藥對不同配伍比例(3：1、2：1、1：1、1：2、1：3)的指紋圖譜；將不同配伍的黃芪—葛根藥對指紋圖譜共有峰相對峰面積與小鼠胃粘膜損傷分數(shù)進行灰色關(guān)聯(lián)分析,通過關(guān)聯(lián)度大小,明確藥對中已鑒別的異黃酮類化學成分對胃粘膜保護作用的貢獻度。3.觀察黃芪—葛根藥對對乙醇誘導大鼠胃粘膜損傷的保護。測量并計算肉眼下胃粘膜損傷分數(shù)與光鏡下病理切片胃粘膜損傷分數(shù)。HE染色病理切片觀察黃芪—葛根藥對對不同實驗組大鼠胃粘膜損傷形態(tài)學的影響。4.觀察藥對對凋亡信號通路關(guān)鍵基因與蛋白的影響。通過Real time PCR、免疫組織化學、Western-blot法檢測藥對對凋亡信號通路Bcl-2/Bax/Caspase-3基因與蛋白表達的影響。結(jié)果：1.黃芪—葛根藥對(2：1配伍)按照煎煮3次,每次30 min,10倍水量的水煎工藝所煎煮的藥液中葛根素含量(15.90±0.04mg/mL)高于其它中藥組,其小鼠胃粘膜損傷分數(shù)(14.8±11.8)低于其它給藥組。黃芪—葛根藥對煎煮30 min,煎煮3次,加10倍水作為本研究的最佳水煎工藝。2.黃芪—葛根藥對不同配伍比例(3：1、2：1、1：1、1：2、1：3)對乙醇誘導小鼠的胃粘膜損傷均有保護作用,均可以降低小鼠胃粘膜的損傷分數(shù),其中3：1配伍組胃粘膜損傷分數(shù)低于其它配伍組,其保護胃粘膜損傷的效果優(yōu)于其它配伍組。與已知對照品比較,鑒別出黃芪—葛根藥對中的8個異黃酮類化學成分分別是：染料木素、染料木苷、葛根素、毛蕊異黃酮、大豆苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素。通過將HPLC指紋圖譜獲得的藥對共有峰峰面積與小鼠胃粘膜損傷分數(shù)相關(guān)聯(lián),得到8種異黃酮類化學成分對胃粘膜保護作用的貢獻度依次為：染料木素葛根素大豆苷元大豆苷芒柄花素毛蕊異黃酮染料木苷毛蕊異黃酮葡萄糖苷。3.肉眼觀察發(fā)現(xiàn),正常組大鼠胃組織粘膜表面呈現(xiàn)淡粉色,粘膜表面連續(xù)、光滑、無破損、無充血；模型組大鼠粘膜色鮮紅、呈現(xiàn)出線狀或斑點狀出血；與模型組相比較,各預防給藥組粘膜損傷較輕,局部僅有少數(shù)點狀出血。HE染色病理切片結(jié)果顯示,正常組大鼠胃粘膜上皮細胞有很好的連續(xù)性、細胞排列緊密有序、固有層腺體排列整齊；與正常組相比較,模型組大鼠粘膜組織遭到破壞,上皮細胞脫落、壞死,腺體排列紊亂,粘膜下層水腫,腺體擴張,有紅細胞外滲；陽性藥(西米替丁)組與藥對高劑量藥組可見少量上皮細胞脫落,損傷情況均輕于模型組,藥對中劑量組與藥對低劑組可見上皮細胞局部脫落,粘膜損傷稍重于西藥組與藥對高劑量組,但均輕于模型組。4.與模型組相比,黃芪—葛根藥對可以上調(diào)Bcl-2基因的mRNA的表達,下調(diào)Bax與Caspase-3基因的mRNA的表達；免疫組化與Western-blot結(jié)果顯示,與模型組相比,黃芪—葛根藥對可以上調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2的表達水平,下調(diào)促凋亡蛋白Bax與Caspase-3的表達,其中西藥組與黃芪—葛根藥對高劑組的效果優(yōu)于藥對中劑組與藥對低劑組。結(jié)論：1.正交試驗優(yōu)選的黃芪—葛根藥對最佳水煎工藝為：煎煮3次、每次30 min,10倍水量。2.黃芪—葛根藥對對乙醇誘導的胃粘膜損傷具有保護作用,其中3：1配伍組保護胃粘膜損傷的效果優(yōu)于其它配伍組；藥對中已鑒別的8種異黃酮化合物中染料木素保護胃粘膜損傷的貢獻度大于葛根素與其它異黃酮類化合物。3.黃芪—葛根藥對可以減輕乙醇導致的胃粘膜出血、水腫、糜爛等病理損傷;其作用機制可能與藥對參與細胞凋亡信號通路,通過上調(diào)抑凋亡基因與蛋白的表達,抑制促凋亡基因與蛋白的表達,抑制胃粘膜細胞凋亡,起到保護胃粘膜的作用。

【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5
【目錄】：

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