發(fā)布時間：2018-01-13 22:23

  本文關鍵詞：慢性HBV感染患者甲基CpG結合結構域家族的研究　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：第一部分慢性乙型肝炎患者甲基CpG結合結構域家族成員的研究研究背景乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染呈全球性流行。目前,全球慢性HBV感染患者大約有2.4億,其中每年因此病致死的人數多達65萬。慢性HBV感染是由HBV復制與宿主免疫應答協同作用而構建的動態(tài)過程。研究表明,表觀遺傳學調控尤其是DNA甲基化參與慢性HBV感染的過程,并在慢性HBV感染患者的結局中發(fā)揮重要作用。甲基CpG結合結構域(methyl-CpG binding domain,MBD)家族蛋白作為表觀遺傳學中DNA甲基化的"讀出器",能夠識別基因組中CpG島上甲基化的胞嘧啶殘基,募集協同抑制因子,從而調控基因表達。此外,MBD蛋白的轉錄抑制作用也體現在染色質重構與組蛋白修飾的相互串擾中。MBD家族主要成員獨特的表觀遺傳學修飾功能,使得它們在腫瘤發(fā)生中可能的作用與機制也被學者所揭示。而最近的研究同時觀察到了 MBD家族主要成員在自身免疫性疾病,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)與類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)等疾病中的變化。然而,慢性HBV感染過程中,MBD家族成員是否存在變化,能否在疾病進展中發(fā)揮表觀遺傳學調控作用,卻仍未被闡明。目的本研究旨在測定慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者MBD家族主要成員的變化,評估其在CHB病情進展中可能的作用與聯系。研究方法本研究納入369例CHB患者與14例正常對照(healthy controls,HCs)人群。369例CHB患者是2014年6月-2016年8月于山東大學齊魯醫(yī)院肝病科收集的。研究組中223例CHB患者是2014年6月-2015年10月收集的,由20例免疫耐受(immune tolerant,IT)期、69例免疫清除(immune clearance,IC)期、103例低(非)復制期(non/low-replicative,LR)期與31 例再活動(HBeAg negative hepatitis,ENH)期患者所構成。驗證組中146例CHB患者是2015年11月-2016年8月收集的,由16例IT期、44例IC期、67例LR期與19例ENH期患者所構成。所有CHB患者中共有40例接受肝穿刺組織病理學檢查,其中研究組有34例,而驗證組僅6例。谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)與血小板(platelet,PLT)比率指數(AST-to-PLT ratio index,APRI)積分被用于CHB患者肝臟纖維化程度的評估。CHB與HCs外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中MBD家族主要成員mRNA的表達情況通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)法測。結果1.CHB患者PBMCs中MeCP2、MBD1、MBD2以及MBD4mRNA水平均高于HCs。但是,CHB患者與HCs的MBD3 mRNA水平無統(tǒng)計學差異。2.CHB患者中MBD家族主要成員mRNA與病情嚴重程度的聯系:CHB患者MBD2 mRNA水平與血清谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)水平間呈正相關(r=0.151,P=0.028),MBD4 mRNA水平與血清ALT(r=0.18,P=0.008)、AST水平(r=0.208,P=0.003)間分別呈正相關。然而,MBD家族其他成員與肝功能指標間并無統(tǒng)計學聯系。3.研究組中,HBeAg陽性患者HBV DNA均為陽性,且此類患者的MBD2與MBD4mRNA相較陰性患者高表達。而HBeAg陰性患者則是由HBV DNA陽性患者(組a)與陰性患者(組b)組成。我們觀察到組a患者PBMCs中MBD2、MBD3、MBD4 mRNA相較組b卻為低表達。4.CHB患者不同免疫分期間比較:CHB患者4個免疫分期PBMCs中MeCP2、MBD1與MBD2mRNA水平均高于HCs。其中,MBD1mRNA水平為IT期顯著高于其他3期;MBD2與MBD4 mRNA水平則為IC期顯著高于其他3期。MBD3 mRNA水平卻是僅IC期高于HCs。MBD4 mRNA水平是除ENH期外,IT、IC與LR期均高于HCs,同時LR期高于ENH期。但是,MeCP2與MBD3 mRNA水平在4個免疫分期間差異無統(tǒng)計學意義。5.MBD1 mRNA對IT期的預測價值:雙變量logistic回歸表明研究組中MBD1 mRNA與IT期密切相關。受試者工作特征(receiver operating characteristics,ROC)曲線顯示,MBD1 mRNA預測IT期的曲線下面積(area under the curve of ROC,AUC)為0.732(P0.001),最佳截斷值為0.0305,靈敏度75%,特異性65.52%。驗證組中則發(fā)現,MBD1 mRNA預測IT期的AUC為0.704(P=0.001),最佳截斷值是0.0305,靈敏度與特異性分別是81.25%與61.54%。6.MBD2與MBD4 mRNA對IC期的預測價值:MBD2與MBD4 mRNA均與IC期密切相關。研究組中,二者預測IC期的AUC分別是0.671(P0.001)和0.716(P0.001),但AUC間統(tǒng)計無意義。MBD2mRNA的最佳截斷值為0.0069,而MBD4 mRNA的最佳截斷值為0.00099。它們的靈敏度、特異性分別是85.51%、44.81%與63.77%、75.97%。雙變量logistic回歸擬合MBD2與MBD4 mRNA聯合變量公式是:參數(MBD2聯合MBD4)=50.591×MBD2+555.483×MBD4-2.314。ROC曲線分析發(fā)現,聯合變量預測IC期的AUC是0.736(P0.001),最佳截斷值是-0.841,靈敏度68.12%,特異性69.48%。而且聯合變量對IC期的預測價值明顯優(yōu)于MBD2mRNA(P=0.0225)。驗證組中,MBD2與MBD4mRNA預測 IC期的AUC分別為0.665(P0.001)和0.741(P0.001)。對應的最佳截斷值、靈敏度、特異性分別是0.0069與0.00099、86.36%與70.45%、42.16%與71.57%。而聯合變量的AUC則是0.754,顯著高于MBD2 mRNA(P=0.004)其最佳截斷值是-0.841,靈敏度與特異度是70.45%與70.59%。7.CHB患者不同肝臟纖維化與炎癥分期下MBD家族主要成員mRNA表達的變化:研究組中,S3+S4期患者MeCP2mRNA水平均高于S0-S2期患者。此外,不同肝臟炎癥分級下MBD家族主要成員中僅MBD2 mRNA水平在G2期是顯著低于G1和G3+G4期。但其他MBD家族成員mRNA在不同肝臟纖維化分級與炎癥分期下表達并無不同。8.MeCP2 mRNA表達對CHB患者肝臟纖維化不同程度的預測意義:MeCP2 mRNA表達與肝臟纖維化程度間有著統(tǒng)計學相關。當S≥2歸為重度纖維化時,MeCP2 mRNA與APRI積分均可預測S≥2纖維化(AUC 0.761 VS 0.716,P=0.707)。而將S3+S4歸為重度纖維化時,MeCP2 mRNA對其的預測價值優(yōu)于APRI積分(AUC 0.958 VS 0.717,P=0.0342),MeCP2 mRNA最佳截斷值是0.0068,靈敏度100%,特異性85.19%。同時,MeCP2 mRNA對S4期纖維化的預測價值也優(yōu)于APRI積分(AUC 0.946 VS 0.677,P=0.0424),其最佳截斷值是0.0084,靈敏度與特異性則是100%與90.32%。這說明,MeCP2 mRNA可以很好的預測反映S3+S4以及S4期纖維化。9.CHB患者MBD家族成員mRNA的相關性分析:Spearman相關分析說明,CHB 患者 PBMCs 中 MeCP2 與 MBD2(r=0.243,P0.001)、MBD1 與 MBD3(r=0.132,P=0.049)、MBD2與MBD3(r=0.209,P=0.002)的mRNA間都有正相關聯系。提示,CHB患者MBD家族主要成員間存在密切聯系。結論1.CHB患者PBMCs中MBD家族主要成員mRNA表達異常。2.PBMCs中MBD1 mRNA的表達對CHB中IT期患者有著很好的預測價值。3.PBMCs中MBD2與MBD4mRNA對CHB中IC期患者有著很好的預測價值,而且MBD2與MBD4 mRNA的聯合變量對IC期的預測價值明顯優(yōu)于MBD2 mRNA。4.PBMCs中MeCP2 mRNA的表達可以反映CHB患者肝臟纖維化的程度。5.MBD家族主要成員參與CHB的發(fā)病過程并與疾病進展間關系密切,提示其在評估CHB病情嚴重程度中的具有較好預測價值。第二部分慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者甲基CpG結合結構域家族成員的研究研究背景慢性乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染包括慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)、隱匿性CHB、乙型肝炎肝硬化、慢加急性乙型肝炎肝衰竭(acute-on-chronic hepatitis B liver failure,ACHBLF)等等。所有慢性HBV感染中病情最為兇險、短期死亡率最高的當屬ACHBLF。該病在短期內出現的肝功能惡化衰竭基于患者原有慢性肝病之上。而在我國,約有八成慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)患者存在基礎的慢性HBV感染,他們即為ACBHLF患者。ACHBLF病情進展迅速、短期死亡率高達85%。時至今日,ACHBLF的治療依舊面臨巨大挑戰(zhàn)。嚴重肝臟疾病患者在病情發(fā)展過程中可能會進入肝衰竭(liver failure,LF),即為LF傾向患者。同時,部分ACHBLF患者病情進展迅速,但是在疾病初始階段表現并不明顯。密切監(jiān)測與早期干預這些可能會進展為ACHBLF或者難治性ACHBLF的患者可能會降低其發(fā)病率與死亡率。所以,早期準確預測ACHBLF極其重要而且尤為迫切。越來越多的學者觀察到,表觀遺傳學修飾介入到了 ACHBLF患者的發(fā)病之中。先前學者已陸續(xù)發(fā)現了 MBD家族成員在腫瘤發(fā)生、自身免疫性疾病中的功能。我們之前也報道了MBD家族主要成員在CHB患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中表達的改變,而且其改變提示MBD家族主要成員在評估CHB病情嚴重程度中具有較好的預測價值。ACHBLF與CHB之間存在顯著不同,它是從慢性感染向爆發(fā)性狀態(tài)轉變的。所以,研究MBD家族在ACHBLF中的作用依舊有重要意義。目的本研究旨在測定ACHBLF患者MBD家族主要成員的變化,探討MBD家族主要成員在疾病進展中的作用,評估其對ACHBLF患者病情預后中可能的預測價值。研究方法本研究納入于山東大學齊魯醫(yī)院肝病科收治的142例ACHBLF患者與80例CHB患者。ACHBLF患者被分為研究組與驗證組,包含研究組92例,是2012年4月-2015年2月收治的患者;驗證組50例,是2015年3月-2016年5月收治的患者。終末期肝病模型(model for end-stage liver disease,MELD)積分用于ACHBLF患者的病情評估。30例健康志愿者從山東大學臨床醫(yī)學院募集,歸為正常對照組(healthy controls,HCs)。所有研究對象PBMCs中MBD家族主要成員mRNA的表達情況通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)法測定。結果1.ACHBLF患者血清白蛋白(albumin,ALB)和凝血酶原活動度(prothrombin activity,PTA)低于CHB和HCs。相反,血清谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、總膽紅素(total bilirubin,TBIL、國際標準化比值(international normalized ratio,INR)則高于CHB和HCs。在研究與驗證組中,死亡組人群均具有較低的PTA和ALB,較高INR、TBIL和MELD積分以及肝性腦病(hepatic encephalopathy,HE)、腹水、自發(fā)性細菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis,SBP)的發(fā)生率。2.MBD家族主要成員mRNA水平的變化:Kruskal-Wallis檢驗發(fā)現ACHBLF患者MBD1和MBD2 mRNA表達均較CHB和HCs上調。相反,ACHBLF患者MBD4 mRNA表達卻明顯低于CHB患者,但高于HCs。此外,ACHBLF患者MeCP2 mRNA表達亦高于HCs。與HCs相比,CHB患者MeCP2、MBD1、MBD2和MBD4 mRNA表達均增多。此外,死亡組患者較存活組患者MBD1和MBD2 mRNA水平明顯升高,而MBD4 mRNA水平則顯著減低。但兩組人群在MeCP2和MBD3的mRNA表達上并無不同。3.ACHBLF患者MBD家族主要成員mRNA水平與臨床指標的聯系:研究組中,MBD4mRNA水平與PTA間存在正相關聯系,而與TBIL、INR和MELD積分間則存在負相關聯系。但其他MBD家族成員mRNA水平與臨床指標間并無統(tǒng)計學相關。Spearman相關分析MBD家族成員間的相關性,發(fā)現ACHBLF患者MeCP2與MBD2(r=0.292,P=0.0055,MBD1與與MBD3(r=0.481,P0.00)mRNA間都有正相關聯系。4.MBD4 mRNA是ACHBLF患者預后的獨立危險因素:Cox比例風險回歸模型表明MELD積分、HE和MBD4 mRNA都是ACHBLF患者預后的獨立危險因素。5.研究組中,MBD4 mRNA表達對ACHBLF患者死亡率的預測價值:MBD4 mRNA預測ACHBLF患者1月死亡率的曲線下面積(area under the curve of receiver operating characteristics,AUC)為0.907,顯著高于MELD積分(0.714,P=0.0291)。說明MBD4 mRNA是一個比MELD積分更好的預測1月死亡率的指標。MBD4mRNA和MELD積分的最佳臨界值分別為0.0005365和21.87,靈敏度與特異性分別為83.33%、92.86%與72.22%、76.69%。研究組按照最佳截斷值分組以比較組間的生存率。Log-rank分析發(fā)現,MBD4mRNA≤0.0005365、MELD積分≥21.87的患者生存率較低,存活時間較短。MBD4 mRNA與MELD積分預測ACHBLF患者2月死亡率的AUC分別為0.816和0.811,最佳截斷值為0.0005469和21.87,敏感度68.09%、93.33%,特異性68.09%、84.44%。Log-rank分析發(fā)現MBD4 mRNA≤0.0005469、MELD積分≥21.87的患者生存率較低,存活時間均較短。MBD4 mRNA與MELD積分預測ACHBLF患者3月死亡率的的AUC分別為0.762和0.847,最佳截斷值為0.0005469和21.55,敏感度62.75%、92.68%,特異性72.55%、87.8%。MBD4mRNA≤0.0005469、MELD積分≥21.55的患者生存率較低,存活時間較短。然而,它們在對患者2月與3月死亡率的預測判斷上沒有差異存在。6.MBD4 mRNA表達對ACHBLF患者死亡率預測價值的驗證:驗證組PBMCs中MBD4 mRNA表達對ACHBLF患者1月死亡率的預測價值明顯優(yōu)于MELD積分(0.939 VS 0.762,P=0.035)。MBD4 mRNA≤0.0005365、MELD積分≥21.87的患者具有較低的生存率與較短的存活時間。在預測ACBHLF患者2月死亡率、3月死亡率上,兩指標間無統(tǒng)計學差異(0.843 VS 0.834,P=0.998)(0.787 VS 0.836,P=0.5037)。在對患者2月死亡率的預測中,MBD4mRNA≤0.0005469、MELD積分≥21.87的患者具有較低的生存率與較短的存活時間。而在3月死亡率的預測中,MBD4mRNA≤0.0005469、MELD積分≥21.55的患者具有較低的生存率以及較短的存活時間。結論1.ACHBLF患者PBMCs中MBD家族主要成員mRNA表達異常。2.PBMCs中MBD4mRNA表達可預測ACHBLF患者1、2、3月死亡率。重要的是,相較MELD積分,PBMCs中MBD4mRNA對ACHBLF患者1月死亡率的預測價值更高。3.ACHBLF患者PBMCs中MBD4 mRNA表達可作為一個非侵入性的預測疾病嚴重程度及早期預后的生物學標志物。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R512.62
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本文編號：1420817