【摘要】 目的：探討臨床中自擬方通竅明目4號(hào)對(duì)青光眼性視神經(jīng)損傷的保護(hù)作用及分子學(xué)作用機(jī)制,為中藥方劑對(duì)神經(jīng)元保護(hù)提供直接證據(jù)。材料和方法：腹腔注射10%水合氯醛(3.8ml/kg)麻醉小鼠,并輔以0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液局部麻醉,并用復(fù)方托比卡胺眼藥水術(shù)眼散瞳。采用單側(cè)前房注射復(fù)方卡波姆溶液的方法在成年SD大鼠上建立慢性高眼壓模型。造模成功后,對(duì)高眼壓—周的大鼠模型,給予通竅明目4號(hào)按照低劑量、中劑量、高劑量進(jìn)行治療兩周,并用維生素B1、B12作為西藥對(duì)照組治療。以大鼠慢性高眼壓模型視網(wǎng)膜內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(stat3)、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、視網(wǎng)膜抗凋亡基因(Bcl-x1)為干預(yù)靶點(diǎn),采用免疫組織化學(xué)、免疫印跡、病理組織學(xué)觀察和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)等方法,從整體及細(xì)胞、基因等多個(gè)層次系統(tǒng)地研究通竅明目4號(hào)對(duì)青光眼的視神經(jīng)保護(hù)作用及分子學(xué)作用機(jī)制,定量分析比較通竅明目4號(hào)的視神經(jīng)保護(hù)作用。兩組之間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組之間比較采用單因素方差分析,p<0.05被認(rèn)為有差異性,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p<0.01為具有及其顯著的差異性。結(jié)果：1.光鏡下空白組視網(wǎng)膜十層結(jié)構(gòu)清晰,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞清晰可見,無水腫。高眼壓后的視網(wǎng)膜早期變厚晚期變薄,隔層結(jié)構(gòu)不清,排列紊亂,空泡狀結(jié)構(gòu)增多,節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少,炎細(xì)胞浸潤。經(jīng)過通竅明目4號(hào)治療后的視網(wǎng)膜損傷明顯輕于模型組,視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)稍紊亂,節(jié)細(xì)胞排列松散,可見空泡樣變,節(jié)細(xì)胞數(shù)量較模型組增多,網(wǎng)膜病變程度減輕。2.電鏡下空白組節(jié)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,視細(xì)胞內(nèi)節(jié)中線粒體豐富,外節(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,膜盤排列緊密。高眼壓模型節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊,細(xì)胞器消失,線粒體腫脹,胞漿空泡變性,突觸融合,膜盤溶解。經(jīng)過藥物治療后空泡變性數(shù)量較模型組減少,節(jié)細(xì)胞膜清晰,胞漿內(nèi)可見結(jié)構(gòu)基本正常的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體。用藥后線粒體水腫減輕,突觸結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰,膜盤融合程度減輕。3.免疫組化及免疫印跡提示：空白組的大鼠視網(wǎng)膜stat3、 Bcl-x1呈低表達(dá),高眼壓模型呈現(xiàn)出1W表達(dá)輕度上升,3W則表達(dá)回落,而經(jīng)過藥物治療后,表達(dá)則明顯上升,提示通竅明目4號(hào)激活了視神經(jīng)保護(hù)通道。結(jié)論：通竅明目4號(hào)可以減輕高眼壓造成的視網(wǎng)膜病理改變,糾正可逆的變性細(xì)胞,減輕高眼壓狀態(tài)下RGCs的凋亡,激活stat3神經(jīng)通路,上調(diào)抗凋亡基因,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,這條通路通過整合包括誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),DNA修復(fù)、線粒體的修復(fù)在內(nèi)的多種方式發(fā)揮作用。因此通竅明目4號(hào)對(duì)青光眼性視神經(jīng)、視網(wǎng)膜的損傷有修復(fù)作用,改善RGCs的生存微環(huán)境,保護(hù)未受損的細(xì)胞,延緩或阻止部分損傷的細(xì)胞繼續(xù)變性。 

前言

尋找理想的慢性高眼壓模型一直是研究青光眼發(fā)病機(jī)制和視神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的難點(diǎn)，常規(guī)的造模方法如鞏膜上靜脈結(jié)扎或燒灼、激光光凝小梁網(wǎng)等均未能形成理想的慢性高眼壓模型，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，成功創(chuàng)造了新的慢性高眼壓動(dòng)物模型。中醫(yī)藥在治療青光眼性視神經(jīng)萎縮方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但是中醫(yī)藥在基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究比較匱乏，中醫(yī)藥對(duì)青光眼的視神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制和有效性，迫切需要基礎(chǔ)研究做理論支撐。以“疏肝通奇”為立方原則的通窮明目4號(hào)，是導(dǎo)師孫河教授多年應(yīng)用于臨床治療的經(jīng)驗(yàn)方，前期臨床研究表明其對(duì)改善視力，視野、VEP等指標(biāo)有著明確的療效，本課題以通宵明目4號(hào)為干預(yù)手段，以大鼠慢性高眼壓模型視網(wǎng)膜內(nèi)轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活因子3(stat3)通路、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs)、視網(wǎng)膜抗凋亡基因（bcl-xl)為干預(yù)紀(jì)點(diǎn)，采用病理組織學(xué)觀察、免疫組織化學(xué)、免疫印跡和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)等方法，從整體及細(xì)胞、基因等多個(gè)層次系統(tǒng)地研究疏肝通鸞法對(duì)青光眼的視神經(jīng)保護(hù)作用及分子學(xué)作用機(jī)制，從而為中藥方劑對(duì)青光眼視神經(jīng)保護(hù)作用的有效性提供依據(jù)，為中藥方劑在國際市場(chǎng)的推廣和應(yīng)用鋪平道路。
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文獻(xiàn)綜述

1. 青光眼視神經(jīng)損害的發(fā)病機(jī)理
眼內(nèi)壓的異常升高是導(dǎo)致青光眼發(fā)病的重要原因[3’ 4]，眼壓升高導(dǎo)致蹄板各層變形且移位，擠壓從蹄孔通過的神經(jīng)纖維，導(dǎo)致視神經(jīng)細(xì)胞的軸衆(zhòng)運(yùn)輸阻滯于篩板區(qū)域，軸菜膜不能利用線粒體產(chǎn)生的ATP，導(dǎo)致各種神經(jīng)營養(yǎng)因子及保護(hù)蛋白的生成和轉(zhuǎn)運(yùn)減少，導(dǎo)致細(xì)胞代謝障礙而死亡6]。但是，眼正并不是青光眼疾病的唯一發(fā)病因素[7]，臨床病例中，有部分患者雖然眼壓超出正常范圍，但是卻沒有出現(xiàn)青光眼的視神經(jīng)損害和視野缺損；還有部分患者眼壓雖然在正常范圍內(nèi)，但是卻具有典型的青光眼損害體征；還有部分青光眼患者經(jīng)過藥物或是手術(shù)和激光治療，眼壓控制在正常范圍內(nèi)，但是視神經(jīng)和視野損害仍在繼續(xù)。因此，機(jī)械學(xué)說不是青光眼發(fā)病的唯一機(jī)制。

2血流學(xué)說
眼球的血液供應(yīng)由視網(wǎng)膜中央血管系統(tǒng)和睫狀血管系統(tǒng)組成。研究…⑴發(fā)現(xiàn)青光眼患者視神經(jīng)動(dòng)脈血流供應(yīng)量下降，血流的阻力指數(shù)增大，并且出現(xiàn)血管痙攣，視網(wǎng)膜、視盤血管變異等病變，病變導(dǎo)致視乳頭的有效灌注壓下降，引發(fā)了視網(wǎng)膜的缺血、缺氧，線粒體產(chǎn)生的ATP減少，Na+/K+-ATP酶失活，大量Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致Ca2+超載，并產(chǎn)生了大量的氧自由基和脂質(zhì)過氧化物，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生了毒性作用；同時(shí)，缺氧導(dǎo)致了大量的興奮性谷氨酸的被釋放，使NMDA等受體活化，啟動(dòng)了 RGCs的凋亡程序，導(dǎo)致視神經(jīng)纖維軸衆(zhòng)流中斷，導(dǎo)致靴源性神經(jīng)營養(yǎng)因子供給中斷，RGCs調(diào)亡研究發(fā)現(xiàn)，青光眼患者的血管疫攣發(fā)病率明顯高于正常人群，其對(duì)閃光點(diǎn)的血管反應(yīng)比常人明顯下降[i4],反復(fù)的閃光點(diǎn)刺激可以改善青光眼患者的血管反應(yīng)，提示青光眼患者血管模式的變化。血管疫攣致使血管阻力升高，使眼部組織血流量降低，進(jìn)而造成青光眼視神經(jīng)損傷。
近期，研究人員通過前房注射微球誘發(fā)小鼠高眼壓的模型，該模型通過微球顆粒在房角邊集阻塞房角，導(dǎo)致房水回流易度加大，使眼壓逐漸升高。市場(chǎng)上可以買到多種直徑的微球，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)要求，選擇合適的直徑微球。該研究者使用了直徑15微米微球進(jìn)行注射，研究結(jié)論認(rèn)為15微米微球可以成功誘導(dǎo)慢性高眼壓，且造成青光眼視神經(jīng)病變的出現(xiàn)。其模型高眼壓約持續(xù)3周，最高眼伍為22.1 土 0.5mmHg,相對(duì)于基礎(chǔ)眼壓9.5±0. 5mtnHg，升高了約12 mniHg，但整體來看眼壓升高幅度不理想。研究證明注射微球的數(shù)量同眼壓升高旳程度和持續(xù)的時(shí)間成正比，并且發(fā)現(xiàn)注射微球誘發(fā)的高眼壓模型，高眼壓狀態(tài)大約維持3周，3周后又恢復(fù)到正常水平，因此需要再次注射微球來維持高眼壓狀態(tài)"5’ 16]，而這樣容易引起眼球感染。

第一部分復(fù)方卡波姆前房注射誘導(dǎo)SD大鼠慢性高眼壓模型的建立 ...........19
1.材料和方法.............19
2.結(jié)果....................24
3討論..........................27
第二部分基于疏肝通竅法對(duì)青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞保護(hù)通路激活的研究 .................32
1.材料和方法.................32
2.結(jié)果...............42
3討論..................47
結(jié)論...........................64

第二部分基于疏肝通窮法對(duì)青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞保護(hù)通路激活的研究

1.材料和方法
本實(shí)驗(yàn)采用北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司的成年SD (SPF級(jí)）大鼠140只（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-(京）2012-0001))，鼠齡在8周到12周之間，體重200土 12.09g,雌雄各半，雌鼠與雌鼠同籠，雄鼠與雄鼠同籠。實(shí)驗(yàn)室選擇在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)中心實(shí)驗(yàn)室，該實(shí)驗(yàn)室是屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK黑2008001。飼養(yǎng)大鼠的籠子為專用籠，具有專門的糞便及垃圾存放盒。飼養(yǎng)室裝備自動(dòng)照明裝置，為白天12小時(shí)黑夜12小時(shí)的定時(shí)周期循環(huán)。鼠籠內(nèi)配有自動(dòng)飲食、飲水裝置。動(dòng)物的飼養(yǎng)和操作均遵循美國視覺和眼科研究學(xué)會(huì)(Association for Research in Vision and Ophthalmology, ARVO)和黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制定的科研動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)室使用規(guī)范。

2結(jié)果
先將甲液充分?jǐn)嚢枞芙�，然后將硫酸銀鉀加入蒸饋水中溶解，并且加熱使其充分溶解，然后將兩種液體混合充分，’然后煮沸，停止加熱后，慢慢加入氧化萊，冷卻后過濾，慢慢加入冰醋酸數(shù)滴。清潔級(jí)SD (SPF級(jí)）大鼠140只，雌雄各半，體重200±12.09g，適應(yīng)性馴養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)室選擇在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)中心實(shí)驗(yàn)室，該實(shí)驗(yàn)室是屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK黑2008001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購置北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，為SD大鼠SPF級(jí)，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京）2012-0001。飼養(yǎng)室自動(dòng)照明裝置實(shí)現(xiàn)12小時(shí)白天12小時(shí)黑夜的定時(shí)周期循環(huán)（照明裝置于早上6點(diǎn)鐘自動(dòng)開啟）。造模前，測(cè)量所有大鼠眼壓，將大鼠眼￡11超出10-21mmHg范圍內(nèi)或是大于等于對(duì)側(cè)眼5mmHg剔除，并補(bǔ)充符合條件的大鼠。造模方法同第一部分。
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結(jié) 論

1.復(fù)方卡波姆溶液前房注射構(gòu)建大鼠模型，眼壓升高達(dá)標(biāo)，持續(xù)時(shí)間長，不良反應(yīng)少；視神經(jīng)、視網(wǎng)膜病理損傷表現(xiàn)典型。成功構(gòu)建大鼠慢性高眼壓模型。2首次發(fā)現(xiàn)青光眼視神經(jīng)損害機(jī)制與Stat3密切相關(guān)，發(fā)生高眼壓時(shí)Stat3表達(dá)升高，發(fā)揮保護(hù)作用，隨高眼壓時(shí)間推移Stat3表達(dá)下降，甚至滅活，表明自身的保護(hù)機(jī)制的短暫性和有限性，及時(shí)的視神經(jīng)保護(hù)不可或缺。3.通窮明目4號(hào)激活了 St at 3信號(hào)通道，使St at 3活化為p- stat3,完成了 JAK-stat3的信號(hào)通路激活過程，上調(diào)了 bcl-XI，有效地保護(hù)了高眼壓下的視神經(jīng)。同時(shí)再次證明了沒有STAT3的激活，神經(jīng)元對(duì)外界剌激十分敏感，會(huì)迅速發(fā)生凋亡。4.通窮明目4號(hào)改善了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞生存的微環(huán)境，保護(hù)未受損的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，修復(fù)受損神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，阻止神經(jīng)節(jié)細(xì)胞調(diào)亡，減輕了高眼壓狀態(tài)下RGCs的凋亡，糾正可逆的變性細(xì)胞，使受損的視網(wǎng)膜全層得到改善，并且高劑量的修復(fù)作用明顯優(yōu)于中、低劑量。

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