植物在進(jìn)化中形成了一系列適應(yīng)環(huán)境的機(jī)制,膜聯(lián)蛋白就是其中之一,它在植物生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)環(huán)境脅迫中發(fā)揮著重要作用。本課題以“川蕎3號(hào)”為研究對(duì)象,對(duì)苦蕎膜聯(lián)蛋白基因及其啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆鑒定,探討該基因的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、亞細(xì)胞分布、組織表達(dá)模式,及其參與苦蕎逆境脅迫的應(yīng)答模式,為進(jìn)一步培育抗逆植物奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：1.采用RACE克隆了一條苦蕎膜聯(lián)蛋白基因,命名為FtANX1。DNA全長(zhǎng)1650bp,含5個(gè)外顯子,4個(gè)內(nèi)含子。CDS全長(zhǎng)942 bp,編碼313個(gè)氨基酸殘基,相對(duì)分子質(zhì)量36.06 KDa,等電點(diǎn)5.94。FtANX1具有4個(gè)典型的annexin保守域,全α-螺旋結(jié)構(gòu),含1個(gè)典型的Ⅱ型Ca2+結(jié)合位點(diǎn)。FtANX1氨基酸序列與其他膜聯(lián)蛋白相似度在49-60%之間。翻譯后修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白含10個(gè)磷酸化位點(diǎn),1個(gè)N-豆蔻酰化位點(diǎn)及1個(gè)細(xì)胞附著位點(diǎn)。Swiss-Model進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)其與甜椒AnnCaP32三維結(jié)構(gòu)相似度最高(50.16%)。聚類(lèi)分析顯示,植物膜聯(lián)蛋白分為四大類(lèi),FtANX1與棉花AnnGh5、草莓Annfaf和苜蓿AnnMt1屬于第二類(lèi)。2.利用genome walking技術(shù)獲得FtANX1基因翻譯起始密碼子(ATG)上游長(zhǎng)約1563 bp序列。序列分析顯示其具有啟動(dòng)子基本的核心元件,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)距ATG上游54 bp；TATA-box距TSS上游31 bp。PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明該啟動(dòng)子含較多生物或非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件。3.采用qRT-PCR技術(shù)分析FtANX1在苦蕎花期組織中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)該基因在所檢測(cè)的組織中均有表達(dá),在未成熟果實(shí)中表達(dá)量最高,成熟果實(shí)、花、莖、根中表達(dá)量次之,葉中表達(dá)量最少,與果實(shí)發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)。4.采用qRT-PCR技術(shù)分析FtANX1在苦蕎逆境脅迫下的表達(dá)模式,結(jié)果表明：與對(duì)照相比,JA、UV-B處理下,FtANX1表達(dá)量在24 h時(shí)分別增加到9.79+0.89、10.71±0.40；NaCl處理下,FtANX1轉(zhuǎn)錄水平增加,且在12h時(shí)較高；寒冷和干旱脅迫下,FtANX1 mRNA積累量在12 h時(shí)表現(xiàn)出明顯的增加,在24 h時(shí)分別進(jìn)一步增加至17.39±0.24、17.6±1.60：Cu和Pb處理下,FtANX1表達(dá)量明顯增加；Zn處理7d時(shí),FtANX1表達(dá)量增加,但14d時(shí)其表達(dá)量急劇下降；Fe和Cd處理7d時(shí), FtANX1 mRNA積累量下降,14d時(shí)其積累量增加,且Cd處理下其積累量增加了1倍；Ni、Mn處理導(dǎo)致FtANX1轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。本研究表明FtANX1響應(yīng)苦蕎幼苗多種環(huán)境脅迫。5.構(gòu)建p163-GFP-FtANX1表達(dá)載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片,對(duì)苦蕎膜聯(lián)蛋白FtANX1進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究。結(jié)果表明FtANX1蛋白定位于細(xì)胞膜中,推測(cè)其參與細(xì)胞分化、胞外分泌等相關(guān)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：Q945.78;Q943.2
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 苦蕎簡(jiǎn)介
    1.2 植物膜聯(lián)蛋白簡(jiǎn)介
        1.2.1 植物中膜聯(lián)蛋白的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 植物膜聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)及分布
        1.2.3 植物細(xì)胞中膜聯(lián)蛋白的功能
    1.3 植物蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位簡(jiǎn)介
    1.4 高等植物啟動(dòng)子簡(jiǎn)介
        1.4.1 啟動(dòng)子的概念
        1.4.2 啟動(dòng)子的基本結(jié)構(gòu)及功能
        1.4.3 啟動(dòng)子的克隆
    1.5 研究目的及意義
    1.6 技術(shù)路線(xiàn)圖
第二章 苦蕎膜聯(lián)蛋白基因及啟動(dòng)子的克隆與序列分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 方法
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 苦蕎總DNA的提取
        2.2.2 苦蕎總RNA的提取
        2.2.3 苦蕎FtANX1基因的克隆
        2.2.4 苦蕎FtANX1基因啟動(dòng)子的克隆
        2.2.5 苦蕎FtANX1基因序列分析
        2.2.6 苦蕎FtANX1基因啟動(dòng)子序列分析
    2.3 討論
第三章 苦蕎膜聯(lián)蛋白基因表達(dá)模式分析
    3.1 材料和方法
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 方法
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 FtANX1基因組織特異性表達(dá)分析
        3.2.2 FtANX1基因響應(yīng)環(huán)境脅迫表達(dá)分析
    3.3 討論
第四章 苦蕎膜聯(lián)蛋白FtANX1亞細(xì)胞定位
    4.1 材料與方法
        4.1.1 植株與試劑
        4.1.2 培養(yǎng)基
        4.1.3 方法
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 GFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.2.2 重組載體在煙草中的瞬時(shí)表達(dá)
    4.3 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文

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