發(fā)布時(shí)間：2024-10-05 05:25

　　斜紋夜蛾（Spodoptera litura）是重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng),危害99科100多種植物,每年給我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失,因此研發(fā)高效的斜紋夜蛾防治方法一直是科研工作者孜孜以求的目標(biāo)。傳統(tǒng)化學(xué)防治方法會(huì)引起斜紋夜蛾產(chǎn)生嚴(yán)重抗性,且農(nóng)藥殘留問(wèn)題也一直是危害人類健康的潛在因素,所以迫切需要開(kāi)發(fā)無(wú)公害防治斜紋夜蛾的方法。近年來(lái),隨著基因組數(shù)據(jù)積累及基因編輯技術(shù)的發(fā)展,非模式昆蟲(chóng)的基因功能解析以及靶標(biāo)基因的篩選成為可能,為更好地開(kāi)發(fā)害蟲(chóng)生物防治方法提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。本研究旨在利用基因編輯技術(shù)研究斜紋夜蛾性別決定通路關(guān)鍵基因,進(jìn)而開(kāi)發(fā)出能夠防治斜紋夜蛾的有效方案。為達(dá)成這一目標(biāo)進(jìn)行了如下研究:第一,利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),構(gòu)建斜紋夜蛾基因組編輯平臺(tái),為研究斜紋夜蛾基因功能奠定基礎(chǔ);第二,尋找斜紋夜蛾性別決定通路和生殖調(diào)控方面關(guān)鍵基因,利用斜紋夜蛾基因組編輯平臺(tái)研究靶標(biāo)基因功能;第三,構(gòu)建斜紋夜蛾害蟲(chóng)防治遺傳調(diào)控品系。相關(guān)研究成果可為斜紋夜蛾害蟲(chóng)防治提供理論基礎(chǔ)和解決方案,具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:1.基于CRISPR/Cas9技術(shù)的斜紋夜蛾基因組編輯平臺(tái)的構(gòu)建CRISPR/Ca...

【文章頁(yè)數(shù)】：131 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 鱗翅目害蟲(chóng)概述
    1.2 斜紋夜蛾概述
        1.2.1 斜紋夜蛾危害特點(diǎn)
        1.2.2 斜紋夜蛾發(fā)生危害規(guī)律
        1.2.3 斜紋夜蛾防控措施
    1.3 昆蟲(chóng)種群遺傳調(diào)控技術(shù)的研究進(jìn)展
        1.3.1 輻射不育技術(shù)研究進(jìn)展
        1.3.2 遺傳調(diào)控技術(shù)研究進(jìn)展
    1.4 昆蟲(chóng)基因組編輯技術(shù)研究進(jìn)展
        1.4.1 ZFNs技術(shù)研究進(jìn)展
        1.4.2 TALENs技術(shù)研究進(jìn)展
        1.4.3 CRISPR/Cas9 技術(shù)研究進(jìn)展
        1.4.4 基因組編輯系統(tǒng)在害蟲(chóng)種群控制方面的研究現(xiàn)狀
    1.5 研究目的和意義
        1.5.1 斜紋夜蛾基是一種世界性分布重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)
        1.5.2 斜紋夜蛾需要新的無(wú)公害防治方法
        1.5.3 構(gòu)建斜紋夜蛾遺傳調(diào)控品系是害蟲(chóng)防治的方向
    1.6 主要研究?jī)?nèi)容
        1.6.1 斜紋夜蛾基因組編輯平臺(tái)的構(gòu)建
        1.6.2 斜紋夜蛾害蟲(chóng)防治靶標(biāo)基因的篩選
        1.6.3 利用基因組編輯平臺(tái)構(gòu)建斜紋夜蛾防治品系
    1.7 技術(shù)路線
第二章 基于基因組編輯技術(shù)的斜紋夜蛾遺傳操作平臺(tái)構(gòu)建
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 RNA提取
        2.2.3 cDNA的合成
        2.2.4 Ebony基因ORF序列的擴(kuò)增
        2.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建
        2.2.6 CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)方法
        2.2.7 表型觀察及基因組DNA突變檢測(cè)
        2.2.8 Real-Time PCR(RT-PCR)檢測(cè)
        2.2.9 斜紋夜蛾人工飼料的配制
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 斜紋夜蛾Ebony基因的序列和進(jìn)化樹(shù)分析
        2.3.2 斜紋夜蛾Ebony基因時(shí)空表達(dá)譜分析
        2.3.3 斜紋夜蛾Ebony基因突變導(dǎo)致蛹?xì)ゎ伾�加�?br>        2.3.4 Ebony基因突變導(dǎo)致斜紋夜蛾成蟲(chóng)顏色加深
        2.3.5 注射Cas9和sgRNA誘導(dǎo)的基因型
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 斜紋夜蛾性別決定關(guān)鍵基因Masc和 Doublesex功能研究.
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 RNA的提取
        3.2.3 cDNA的合成
        3.2.4 擴(kuò)增Masc和 Doublesex基因的ORF序列
        3.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建
        3.2.6 CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)方法
        3.2.7 表型觀察及基因組DNA突變檢測(cè)
        3.2.8 Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)檢測(cè)
        3.2.9 數(shù)據(jù)分析
        3.2.10 Masc過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
        3.2.11 質(zhì)粒大量提取與純化
        3.2.12 細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法
        3.2.13 精子染色
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 SlMasc基因在BmN雌性卵巢細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染
        3.3.2 過(guò)表達(dá)SlMasc基因?qū)е滦坌訢oublesex剪接體出現(xiàn)
        3.3.3 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的SlMasc基因的突變檢測(cè)
        3.3.4 SlMasc基因突變導(dǎo)致雄性個(gè)體外生殖器畸形
        3.3.5 SlMasc基因突變導(dǎo)致雌性比例異常
        3.3.6 SlDoublesex基因進(jìn)化保守性分析
        3.3.7 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的SlDoublesex基因突變
        3.3.8 SlDoublesex基因突變導(dǎo)致雌雄內(nèi)外生殖器異常
        3.3.9 qPCR鑒定相關(guān)基因的表達(dá)
        3.3.10 SlDoublesex基因突變導(dǎo)致雌雄不育
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 基于基因組編輯技術(shù)的斜紋夜蛾不育品系的構(gòu)建研究
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 RNA的提取
        4.2.3 cDNA的合成
        4.2.4 擴(kuò)增Ser2和Osp基因的ORF序列
        4.2.5 CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)方法
        4.2.6 表型觀察及基因組DNA突變檢測(cè)
        4.2.7 Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)檢測(cè)
        4.2.8 數(shù)據(jù)分析
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 斜紋夜蛾Ser2 基因時(shí)空表達(dá)譜分析
        4.3.2 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的斜紋夜蛾Ser2 基因突變
        4.3.3 斜紋夜蛾Ser2 基因突變導(dǎo)致成蟲(chóng)雄性不育
        4.3.4 Ser2 雄性不育可遺傳性檢測(cè)
        4.3.5 qPCR檢測(cè)Ser2 突變下游基因變化
        4.3.6 斜紋夜蛾Osp基因時(shí)空表達(dá)譜分析
        4.3.7 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的斜紋夜蛾Osp基因突變
        4.3.8 斜紋夜蛾Osp基因突變導(dǎo)致成蟲(chóng)雌性不育
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 總結(jié)與展望
    5.1 研究總結(jié)
    5.2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
    5.3 不足與展望
參考文獻(xiàn)
附錄一 實(shí)驗(yàn)主要藥品試劑
附錄二 實(shí)驗(yàn)主要儀器
附錄三 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及參與的項(xiàng)目
致謝



本文編號(hào)：4007584