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綿羊肺炎支原體延伸因子EF-P基因的克

發(fā)布時(shí)間:2024-07-06 08:52
  為篩選綿羊肺炎支原體(MO)免疫相關(guān)蛋白,以MO新疆流行株基因組DNA為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增其EF-P基因,測(cè)序后對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行分子特征分析;用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)其抗原表位集中區(qū)編碼片段;進(jìn)一步將該基因片段克隆入pET-32a(+)中,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a(+)-EF-P,將pET-32a(+)-EF-P質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Escherichia coli BL21(DE3)中,IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)后,檢測(cè)重組蛋白反應(yīng)原性和免疫原性。SDS-PAGE結(jié)果顯示,EF-P重組蛋白分子質(zhì)量為29.5ku;Western blot結(jié)果顯示,該重組蛋白可被MO陽(yáng)性血清特異性識(shí)別,證實(shí)其具有良好的反應(yīng)原性;小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示,該重組蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體,采用正向間接血凝方法檢測(cè)效價(jià)可達(dá)1∶64,提示其具有較強(qiáng)的免疫原性。

【文章頁(yè)數(shù)】:7 頁(yè)

【部分圖文】:

圖1MOEF-P基因的PCR擴(kuò)增M.DNAmarkerDL2000;1~4.菌液PCR產(chǎn)物PCRprod-uctsofbacterialliquid

圖1MOEF-P基因的PCR擴(kuò)增M.DNAmarkerDL2000;1~4.菌液PCR產(chǎn)物PCRprod-uctsofbacterialliquid

4個(gè)N-;稽c(diǎn),在51~66位氨基酸處有1個(gè)GTP結(jié)合延伸因子標(biāo)簽(圖2)。利用在線軟件BepiPred1.0bServer預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),在109~205位氨基酸處有4個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位;經(jīng)DNAMAN分析發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)不存在終止密碼子,可正常翻譯;MotifScan在線軟件分析發(fā)現(xiàn)....


圖3PSIPRED軟件預(yù)測(cè)的EF-P二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3Predictedsecondaryandtertiarystructure

圖3PSIPRED軟件預(yù)測(cè)的EF-P二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3Predictedsecondaryandtertiarystructure

雙酶切后得到目的片段和pET-32a(+)載體片段(圖6),表明成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-EF-P。2.5表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Westernblot分析SDS-PAGE分析顯示,IPTG誘導(dǎo)的樣品在29.5ku處有明顯條帶,且與理論分析值相符,重組菌在IP....


圖4EF-P基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig.4PhylogenetictreeofMycoplasmaspeciesbasedonEF-Pgene

圖4EF-P基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig.4PhylogenetictreeofMycoplasmaspeciesbasedonEF-Pgene

分析SDS-PAGE分析顯示,IPTG誘導(dǎo)的樣品在29.5ku處有明顯條帶,且與理論分析值相符,重組菌在IPTG誘導(dǎo)8h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。Westernblot分析結(jié)果表明,重組蛋白可被MO陽(yáng)性血清識(shí)別,說(shuō)明重組蛋白EF-P具有較好的反應(yīng)原性(圖7)。圖3PSIPRED軟件預(yù)測(cè)的....


圖5EF-P的PCR鑒定M.DNAmarkerDL2000;1~3.菌液PCR產(chǎn)物PCRprod-uctsofbacterialliquid

圖5EF-P的PCR鑒定M.DNAmarkerDL2000;1~3.菌液PCR產(chǎn)物PCRprod-uctsofbacterialliquid

(圖7)。圖3PSIPRED軟件預(yù)測(cè)的EF-P二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3PredictedsecondaryandtertiarystructureofEF-PbyusingPSIPREDsoftware圖4EF-P基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig.4PhylogenetictreeofMy....



本文編號(hào):4002352

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