為篩選綿羊肺炎支原體(MO)免疫相關(guān)蛋白,以MO新疆流行株基因組DNA為模板,通過PCR擴(kuò)增其EF-P基因,測序后對其編碼蛋白進(jìn)行分子特征分析;用生物信息學(xué)軟件預(yù)測其抗原表位集中區(qū)編碼片段;進(jìn)一步將該基因片段克隆入pET-32a(+)中,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a(+)-EF-P,將pET-32a(+)-EF-P質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Escherichia coli BL21(DE3)中,IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)后,檢測重組蛋白反應(yīng)原性和免疫原性。SDS-PAGE結(jié)果顯示,EF-P重組蛋白分子質(zhì)量為29.5ku;Western blot結(jié)果顯示,該重組蛋白可被MO陽性血清特異性識別,證實(shí)其具有良好的反應(yīng)原性;小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示,該重組蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體,采用正向間接血凝方法檢測效價(jià)可達(dá)1∶64,提示其具有較強(qiáng)的免疫原性。

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圖１ＭＯＥＦ－Ｐ基因的ＰＣＲ擴(kuò)增Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００；１～４．菌液ＰＣＲ產(chǎn)物ＰＣＲｐｒｏｄ－ｕｃｔｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｌｉｑｕｉｄ

４個(gè)Ｎ－�；�化位點(diǎn)，在５１～６６位氨基酸處有１個(gè)ＧＴＰ結(jié)合延伸因子標(biāo)簽（圖２）。利用在線軟件ＢｅｐｉＰｒｅｄ１．０ｂＳｅｒｖｅｒ預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在１０９～２０５位氨基酸處有４個(gè)優(yōu)勢抗原表位；經(jīng)ＤＮＡＭＡＮ分析發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)不存在終止密碼子，可正常翻譯；ＭｏｔｉｆＳｃａｎ在線軟件分析發(fā)現(xiàn)....

圖３ＰＳＩＰＲＥＤ軟件預(yù)測的ＥＦ－Ｐ二級與三級結(jié)構(gòu)Ｆｉｇ．３Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｄｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ

雙酶切后得到目的片段和ｐＥＴ－３２ａ（＋）載體片段（圖６），表明成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒ｐＥＴ－３２ａ（＋）－ＥＦ－Ｐ。２．５表達(dá)產(chǎn)物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析顯示，ＩＰＴＧ誘導(dǎo)的樣品在２９．５ｋｕ處有明顯條帶，且與理論分析值相符，重組菌在ＩＰ....

圖４ＥＦ－Ｐ基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Ｆｉｇ．４ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＭｙｃｏｐｌａｓｍａｓｐｅｃｉｅｓｂａｓｅｄｏｎＥＦ－Ｐｇｅｎｅ

分析ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析顯示，ＩＰＴＧ誘導(dǎo)的樣品在２９．５ｋｕ處有明顯條帶，且與理論分析值相符，重組菌在ＩＰＴＧ誘導(dǎo)８ｈ時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析結(jié)果表明，重組蛋白可被ＭＯ陽性血清識別，說明重組蛋白ＥＦ－Ｐ具有較好的反應(yīng)原性（圖７）。圖３ＰＳＩＰＲＥＤ軟件預(yù)測的....

圖５ＥＦ－Ｐ的ＰＣＲ鑒定Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００；１～３．菌液ＰＣＲ產(chǎn)物ＰＣＲｐｒｏｄ－ｕｃｔｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｌｉｑｕｉｄ

（圖７）。圖３ＰＳＩＰＲＥＤ軟件預(yù)測的ＥＦ－Ｐ二級與三級結(jié)構(gòu)Ｆｉｇ．３ＰｒｅｄｉｃｔｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｄｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＥＦ－ＰｂｙｕｓｉｎｇＰＳＩＰＲＥＤｓｏｆｔｗａｒｅ圖４ＥＦ－Ｐ基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Ｆｉｇ．４ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＭｙ....

本文編號：4002352