發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 04:35

　　 大黃魚(Larimichthys crocea)是我國(guó)特有的最重要的海水經(jīng)濟(jì)魚類之一,在生長(zhǎng)上存在性別二態(tài)性,但是目前對(duì)其性別決定機(jī)制的了解還比較欠缺。對(duì)大黃魚性別決定關(guān)鍵基因的研究,有助于今后繁殖生產(chǎn)和育種工作的開展。本研究從在大黃魚精巢特異性表達(dá)的Dmrt1基因入手,克隆了其全長(zhǎng)cDNA及X和Y染色體上Dmrt1基因(分別稱為L(zhǎng)cDmrt1~X和LcDmrt1~Y)的啟動(dòng)子序列,構(gòu)建了該基因的表達(dá)載體注射到青鳉受精卵觀察其表達(dá)和對(duì)青鳉性別發(fā)育的影響,并通過構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體,對(duì)啟動(dòng)子活性區(qū)域進(jìn)行了初步分析。主要研究結(jié)果如下:1、通過RACE技術(shù)獲得了大黃魚Dmrt1基因(LcDmrt1)的全長(zhǎng)cDNA序列,共3037bp,其中包括918 bp的ORF,132 bp的5’UTR和1932 bp的3’UTR。以大黃魚BAC文庫(kù)中包含Dmrt1基因的X和Y染色體片段的單克隆為模板擴(kuò)增了Dmrt1基因啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列,發(fā)現(xiàn)兩者之間存在許多SNP和插入缺失變異。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果表明,LcDmrt1的啟動(dòng)區(qū)存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),包括TATA結(jié)合蛋白(TBP)、SMAD2以及性別相關(guān)蛋白SOX家族成員(SOX5、SOX10、SOX17)和SRY等結(jié)合位點(diǎn);其中,LcDmrt1~Y在-1375 bp處含有1個(gè)特異的TBP結(jié)合位點(diǎn),LcDmrt1~X在-1813 bp處和在-2416bp處分別有一個(gè)特異的SOX5結(jié)合位點(diǎn)和SRY結(jié)合位點(diǎn)。此外,LcDmrt1~Y在啟動(dòng)子區(qū)還含有2個(gè)DMRT1結(jié)合位點(diǎn),分別位于-1040 bp和-287 bp處,而LcDmrt1~X有3個(gè)DMRT1的結(jié)合位點(diǎn),分別位于-1820 bp,-1048 bp和-298 bp處,其中-1820處的DMRT1結(jié)合位點(diǎn)是X染色體特異的。2、利用克隆的大黃魚Dmrt1全長(zhǎng)cDNA成功構(gòu)建了PCS2-LcDmrt1過表達(dá)載體,利用顯微注射技術(shù)導(dǎo)入模式魚青鳉受精卵中,觀察LcDmrt1在青鳉體內(nèi)的基因整合、表達(dá)和對(duì)青鳉性別發(fā)育的影響。結(jié)果表明,注射48 h后,LcDmrt1基因在青鳉胚胎內(nèi)大量表達(dá),孵化后40 d的稚魚中LcDmrt1的整合率為24.3%,并觀察到1尾遺傳型為XX的青鳉發(fā)育成了雄魚,表明LcDmrt1具有誘導(dǎo)青鳉雌魚性腺分化發(fā)育成精巢的作用。3、構(gòu)建了含有LcDmrt1~X和LcDmrt1~Y不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子序列的雙熒光素酶報(bào)告載體Pro-D2K-X(-1983,+133)、Pro-D2K-Y(-1975,+133)、Pro-D700-X(-615,+133)和Pro-D700-Y(-607,+133)。分別共轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞系(HEK-293)檢測(cè)其表達(dá)活性。結(jié)果表明,LcDmrt1~X和LcDmrt1~Y啟動(dòng)子都有活性,LcDmrt1~Y的啟動(dòng)子活性高于LcDmrt1~X的啟動(dòng)子。將上述4種啟動(dòng)子活性分析質(zhì)粒分別與PCS2-LcDmrt1共轉(zhuǎn)染,觀察LcDmrt1是否有自我反饋的調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果表明,過表達(dá)LcDmrt1會(huì)降低啟動(dòng)子活性,說明大黃魚DMRT1具有具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用,結(jié)合LcDmrt1~Y啟動(dòng)子的表達(dá)活性明顯高于LcDmrt1~X的結(jié)果分析,表明LcDmrt1的抑制程度可能與其啟動(dòng)子區(qū)DMRT1結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目有關(guān),其中包含3個(gè)DMRT1結(jié)合位點(diǎn)的LcDmrt1~X的啟動(dòng)子活性受到抑制的程度明顯高于2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的LcDmrt1~Y啟動(dòng)子。此外,LcDmrt1~Y的這種自我抑制作用具有劑量效應(yīng),具有2個(gè)DMRT1結(jié)合位點(diǎn)的Pro-D2K-Y啟動(dòng)子活性受到抑制的程度顯著高于只有1個(gè)DMRT1結(jié)合位點(diǎn)的Pro-D700-Y的啟動(dòng)子活性(p0.05);而LcDmrt1~X的結(jié)果正好相反,共轉(zhuǎn)染后Pro-D700-X表達(dá)活性下降幅度極顯著大于Pro-D2K-X,暗示(-615 bp,0)區(qū)域中的結(jié)合位點(diǎn)可能是該啟動(dòng)子接受DMRT1的負(fù)反饋調(diào)節(jié)的主要位點(diǎn)。本研究獲得了大黃魚Dmrt1基因cDNA全長(zhǎng)序列和X與Y染色體上該基因的啟動(dòng)子序列,并成功構(gòu)建了一系列表達(dá)質(zhì)粒,初步揭示了DMRT1的功能及X、Y染色體上LcDmrt1啟動(dòng)子的表達(dá)特性,研究結(jié)果為闡明大黃魚性別決定與分化的分子機(jī)制,提供了良好的基礎(chǔ)和有價(jià)值的研究資料。
【學(xué)位單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 魚類性別決定與分化
        1.1.1 遺傳型性別決定（GSD）
        1.1.2 環(huán)境型性別決定（ESD）
    1.2 性別決定基因的研究進(jìn)展
        1.2.1 Sox基因家族
        1.2.2 Dmrt基因家族
        1.2.3 芳香化酶基因
        1.2.4 Vasa基因
        1.2.5 其他性別分化相關(guān)基因
    1.3 啟動(dòng)子的研究進(jìn)展
    1.4 大黃魚性別研究背景
        1.4.1 大黃魚簡(jiǎn)介
        1.4.2 大黃魚性腺發(fā)育和性別分化的研究
        1.4.3 大黃魚性別相關(guān)基因的研究
    1.5 本研究的目的及意義
第2章 大黃魚Dmrt1基因全長(zhǎng)cDNA和啟動(dòng)子的克隆與分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 培養(yǎng)基配制
        2.1.5 常用溶液配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 基因組DNA提取
        2.2.2 大黃魚個(gè)體遺傳性別鑒定
        2.2.3 大黃魚精巢總RNA提取
        2.2.4 大黃魚Dmrt1基因3’和5’端序列的克隆
        2.2.5 大黃魚Dmrt1基因啟動(dòng)子序列克隆及分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 大黃魚遺傳性別鑒定
        2.3.2 大黃魚Dmrt1基因3’RACE和5’RACE結(jié)果
        2.3.3 Dmrt1基因啟動(dòng)子序列的克隆與分析結(jié)果
    2.4 討論
第3章 大黃魚Dmrt1基因在青鳉的表達(dá)及其效應(yīng)
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 大黃魚Dmrt1基因cDNA第一條鏈合成
        3.2.2 大黃魚Dmrt1基因cDNA第一條鏈的檢測(cè)
        3.2.3 大黃魚Dmrt1基因過表達(dá)載體構(gòu)建
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 大黃魚Dmrt1基因CDS全長(zhǎng)擴(kuò)增
        3.3.2 大黃魚Dmrt1基因表達(dá)載體構(gòu)建
        3.3.3 注射后青鳉胚胎的RFP表達(dá)情況
        3.3.4 大黃魚Dmrt1表達(dá)載體在青鳉體內(nèi)整合情況
    3.4 討論
第4章 大黃魚Dmrt1基因啟動(dòng)子的活性分析
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 LcDmrt1不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子片段質(zhì)粒的構(gòu)建和活性分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 LcDmrt1不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子片段質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.2 LcDmrt1不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子片段質(zhì)粒的活性測(cè)定
        4.3.3 LcDmrt1對(duì)LcDmrt1啟動(dòng)子活性影響
    4.4 討論
第5章 結(jié)論與展望
    5.1 研究結(jié)論
    5.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    5.3 展望
致謝
參考文獻(xiàn)
在校期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文

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本文編號(hào)：2890958