發(fā)布時間：2020-11-22 09:55

　　 目的:三黃瀉心湯作為經(jīng)典方劑臨床上常用于動脈粥樣硬化,上呼吸道感染,糖尿病腎病,胃炎胃潰瘍等疾病的治療,化學(xué)成分研究顯示其主要含有大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、鹽酸小檗堿、黃連堿、巴馬汀、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等成分。課題組前期研究炎癥通路級聯(lián)放大效應(yīng)探索了大黃-黃芩“相使為用”增效的分子機制,建立了LPS誘導(dǎo)小鼠腹膜巨噬細胞Raw264.7炎癥模型,以對LPS介導(dǎo)產(chǎn)生NO的抑制作用為評價指標(biāo),對黃連5個主要單體成分進行了活性篩選,針對抑制活性最佳的黃連堿對該模型中NF-κB、MAPK以及JAK/STAT炎癥信號通路的激活進行了深入研究。然而,研究未涉及三黃瀉心湯成分對NLRP3炎癥小體通路的影響。Caspase-1作為NLRP3炎癥小體的重要組成部分之一,通過體外構(gòu)建caspase-1抑制劑篩選體系,再對三黃瀉心湯主要單體成分進行目的性篩選,可為三黃瀉心湯以及單體成分的臨床使用提供理論依據(jù)。方法:(1)以caspase-1 c DNA為模板,分別以(BamH I-p20,p20-Sal I)、(BamH I-p10,p10-Sal I)以及(BamH I-p20,p10-Sal I)為上下游引物,進行PCR擴增后,使用限制性內(nèi)切酶Sal I、BamHI分別消化擴增后的產(chǎn)物以及原核表達載體pColdI,采用T4連接酶將目的片段與原核載體連接成重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化如宿主細胞并進行復(fù)制,利用載體自身具備的抗Amp抗生素基因,篩出重組質(zhì)粒;(2)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達感受態(tài)細胞Trans BL21(DE3),利用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在原核表達系統(tǒng)中誘導(dǎo)外源基因的表達。pCold I載體攜帶冷應(yīng)激基因cspA啟動子,能夠在低溫條件下表達,通過抑制其他蛋白質(zhì)的表達來提高目的蛋白的產(chǎn)量。(3)親和層析法純化蛋白:pCold I載體攜帶6×His標(biāo)簽(His-tag),該標(biāo)簽?zāi)軌蚺c二價金屬離子,如Ni~(2+)、Co~(2+)等螯合,通過親和層析的方法對目標(biāo)蛋白進行純化。(4)構(gòu)建caspase-1體外活性篩選體系,對三黃瀉心湯主要單體成分小檗堿(Ber)、黃連堿(Cop)、表小檗堿(Epi)、巴馬汀(Pal)、藥根堿(Jatr)、大黃酸(Rhe)、大黃素(Emo)、蘆薈大黃素(Alo)、大黃酚(Chry)、大黃素甲醚(Phy)、黃芩苷(Bae)、黃芩素(Bai)、漢黃芩素(Wogi)以及漢黃芩苷(Woga)進行抑制活性篩選,終濃度50μM;以VX-765(100nM)為陽性對照;(5)Raw264.7細胞接種于6孔板,密度達到80%換無血清培養(yǎng)基,黃連堿(1-30μM)作用2h后,LPS(1μg/mL)繼續(xù)刺激24h,裂解細胞;SDS-PAGE上樣檢測,分別使用anti-TLR-4和anti-MyD88一抗檢測各組蛋白表達;(6)Raw264.7細胞接種于6孔板中過夜培養(yǎng),以Cop(1-30μM)、Ber 30μM預(yù)處理1h后加入Alexa Fluor 488 conjugated LPS孵育20min。使用4%多聚甲醛固定20min,TLR-4一抗于4℃條件下孵育2h,Alexa Fluor 545 conjugate二抗孵育1h,于激光共聚焦顯微鏡下觀察。(7)THP-1細胞接種于24孔板中,100nM PMA誘導(dǎo)24h貼壁。用不含血清培養(yǎng)基換液,(1-30μM)Cop預(yù)處理1h后,分別采用IFN-γ(1000U)以及IFN-γ(1000U)+LPS(1μg/ml)繼續(xù)刺激24h后,收集培養(yǎng)基上清,用于NO水平的檢測。(8)SD大鼠腳底皮下注射角叉菜膠(carrageenan)建立足腫脹模型,使用足趾容積檢測儀0-4h內(nèi)檢測黃連堿對carrageenan誘導(dǎo)的大鼠足腫脹以及體表溫度升高的影響;收集大鼠腫脹部位皮下組織,冰面上勻漿,離心后得到勻漿液上清,采用Elisa法檢測各組大鼠腫脹部位組織中細胞因子NO以及TNF-α的水平。結(jié)果:(1)PCR擴增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,在1000bp左右能看見明顯的特異性條帶;p20、p10、p10(D381E)、p20p10以及p20p10(D381E)與pCold I雙酶切后,連接酶分別連接過夜并轉(zhuǎn)化進DH5α感受態(tài)細胞,挑取5個單克隆進行酶切鑒定以及菌落的PCR鑒定,結(jié)合測序結(jié)果表明所篩選的菌落為陽性克隆;(2)考馬斯亮藍染色,結(jié)果表明IPTG誘導(dǎo)后,p20、p10以及p20p10蛋白大量表達,在25kDa、14.4kDa以及45kD左右有明顯條帶;(3)親和層析法純化以上蛋白后,在包含Ac-WEHD-AMC的體系中不具有剪切活性;將上述蛋白純化前的裂解液上清加入體系中,結(jié)果顯示p20p10與p20p10(D381E)裂解液上清具備剪切活性;(4)以上瀉心湯單體成分中,Cop、Jatr以及Emodin對caspase-1的活性抑制率大于60%。Cop抑制效果最佳,IC_(50)=31.66±0.22μM;(5)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞TLR-4以及MyD88蛋白表達升高,(1-30μM)黃連堿對其無明顯抑制作用;(6)黃連堿1-30μM對LPS和TLR-4的綁定無明顯作用,而小檗堿30μM,與報道相符,可顯著抑制該綁定;(7)IFN-γ(1000U)以及IFN-γ(1000U)+LPS(1μg/ml)均可刺激THP-1細胞釋放NO,高劑量Cop對其有一定的抑制作用。(8)皮下注射角叉菜膠引起大鼠足腫脹以及腫脹部位體表溫度升高,黃連堿3.87mg/kg顯著抑制大鼠足腫脹程度,同時顯著減少腫脹部位組織勻漿中NO和TNF-α的產(chǎn)量。結(jié)論:(1)三黃瀉心湯主要單體成分均對caspase-1剪切活性有不同程度的抑制作用,其中黃連堿的抑制作用最強;(2)黃連堿對LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細胞TLR-4和MyD88蛋白高表達無明顯抑制作用,對TLR-4與LPS綁定無影響;(3)黃連堿抑制IFN-γ以及IFN-γ+LPS誘導(dǎo)的THP-1細胞NO釋放;(4)黃連堿對角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足腫脹有明顯改善作用。
【學(xué)位單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文作為不溶蛋白分別構(gòu)建、表達、純化caspase大小亞基單一可溶性蛋白構(gòu)建、表達并純化全長的caspase-1[40,4別在包涵體中表達時，需要再折疊后純化才能得到有剪樣的，表達全長的caspase-1后也需要復(fù)性、純化從而在]。相反的，亦有文獻證實在純化caspase過程中可不用序[43]。由于caspase-1 p10亞基不穩(wěn)定，能自噬為p7，性失活，目前主要采用兩種方法抑制p10自噬，分別為酸鈉[44]以及對p10進行點突變處理（D381E）[43]。通過，利用帶熒光標(biāo)簽的底物（如Ac-WEHD-AMC）可用于篩]。

成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文4見以下圖2、圖3：圖2：體外表達純化caspase-1蛋白技術(shù)路線圖，五角星代表關(guān)鍵步驟圖3：紅色五角星表示課題組前期實驗已完成內(nèi)容，問號表示本論文待解決問題

成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文4見以下圖2、圖3：圖2：體外表達純化caspase-1蛋白技術(shù)路線圖，五角星代表關(guān)鍵步驟圖3：紅色五角星表示課題組前期實驗已完成內(nèi)容，問號表示本論文待解決問題
【參考文獻】

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本文編號：2894519