發(fā)布時(shí)間：2020-11-22 09:55

　　 目的:三黃瀉心湯作為經(jīng)典方劑臨床上常用于動(dòng)脈粥樣硬化,上呼吸道感染,糖尿病腎病,胃炎胃潰瘍等疾病的治療,化學(xué)成分研究顯示其主要含有大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、鹽酸小檗堿、黃連堿、巴馬汀、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等成分。課題組前期研究炎癥通路級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)探索了大黃-黃芩“相使為用”增效的分子機(jī)制,建立了LPS誘導(dǎo)小鼠腹膜巨噬細(xì)胞Raw264.7炎癥模型,以對(duì)LPS介導(dǎo)產(chǎn)生NO的抑制作用為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)黃連5個(gè)主要單體成分進(jìn)行了活性篩選,針對(duì)抑制活性最佳的黃連堿對(duì)該模型中NF-κB、MAPK以及JAK/STAT炎癥信號(hào)通路的激活進(jìn)行了深入研究。然而,研究未涉及三黃瀉心湯成分對(duì)NLRP3炎癥小體通路的影響。Caspase-1作為NLRP3炎癥小體的重要組成部分之一,通過(guò)體外構(gòu)建caspase-1抑制劑篩選體系,再對(duì)三黃瀉心湯主要單體成分進(jìn)行目的性篩選,可為三黃瀉心湯以及單體成分的臨床使用提供理論依據(jù)。方法:(1)以caspase-1 c DNA為模板,分別以(BamH I-p20,p20-Sal I)、(BamH I-p10,p10-Sal I)以及(BamH I-p20,p10-Sal I)為上下游引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,使用限制性內(nèi)切酶Sal I、BamHI分別消化擴(kuò)增后的產(chǎn)物以及原核表達(dá)載體pColdI,采用T4連接酶將目的片段與原核載體連接成重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化如宿主細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制,利用載體自身具備的抗Amp抗生素基因,篩出重組質(zhì)粒;(2)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞Trans BL21(DE3),利用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在原核表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。pCold I載體攜帶冷應(yīng)激基因cspA啟動(dòng)子,能夠在低溫條件下表達(dá),通過(guò)抑制其他蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)提高目的蛋白的產(chǎn)量。(3)親和層析法純化蛋白:pCold I載體攜帶6×His標(biāo)簽(His-tag),該標(biāo)簽?zāi)軌蚺c二價(jià)金屬離子,如Ni~(2+)、Co~(2+)等螯合,通過(guò)親和層析的方法對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化。(4)構(gòu)建caspase-1體外活性篩選體系,對(duì)三黃瀉心湯主要單體成分小檗堿(Ber)、黃連堿(Cop)、表小檗堿(Epi)、巴馬汀(Pal)、藥根堿(Jatr)、大黃酸(Rhe)、大黃素(Emo)、蘆薈大黃素(Alo)、大黃酚(Chry)、大黃素甲醚(Phy)、黃芩苷(Bae)、黃芩素(Bai)、漢黃芩素(Wogi)以及漢黃芩苷(Woga)進(jìn)行抑制活性篩選,終濃度50μM;以VX-765(100nM)為陽(yáng)性對(duì)照;(5)Raw264.7細(xì)胞接種于6孔板,密度達(dá)到80%換無(wú)血清培養(yǎng)基,黃連堿(1-30μM)作用2h后,LPS(1μg/mL)繼續(xù)刺激24h,裂解細(xì)胞;SDS-PAGE上樣檢測(cè),分別使用anti-TLR-4和anti-MyD88一抗檢測(cè)各組蛋白表達(dá);(6)Raw264.7細(xì)胞接種于6孔板中過(guò)夜培養(yǎng),以Cop(1-30μM)、Ber 30μM預(yù)處理1h后加入Alexa Fluor 488 conjugated LPS孵育20min。使用4%多聚甲醛固定20min,TLR-4一抗于4℃條件下孵育2h,Alexa Fluor 545 conjugate二抗孵育1h,于激光共聚焦顯微鏡下觀察。(7)THP-1細(xì)胞接種于24孔板中,100nM PMA誘導(dǎo)24h貼壁。用不含血清培養(yǎng)基換液,(1-30μM)Cop預(yù)處理1h后,分別采用IFN-γ(1000U)以及IFN-γ(1000U)+LPS(1μg/ml)繼續(xù)刺激24h后,收集培養(yǎng)基上清,用于NO水平的檢測(cè)。(8)SD大鼠腳底皮下注射角叉菜膠(carrageenan)建立足腫脹模型,使用足趾容積檢測(cè)儀0-4h內(nèi)檢測(cè)黃連堿對(duì)carrageenan誘導(dǎo)的大鼠足腫脹以及體表溫度升高的影響;收集大鼠腫脹部位皮下組織,冰面上勻漿,離心后得到勻漿液上清,采用Elisa法檢測(cè)各組大鼠腫脹部位組織中細(xì)胞因子NO以及TNF-α的水平。結(jié)果:(1)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),在1000bp左右能看見(jiàn)明顯的特異性條帶;p20、p10、p10(D381E)、p20p10以及p20p10(D381E)與pCold I雙酶切后,連接酶分別連接過(guò)夜并轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取5個(gè)單克隆進(jìn)行酶切鑒定以及菌落的PCR鑒定,結(jié)合測(cè)序結(jié)果表明所篩選的菌落為陽(yáng)性克隆;(2)考馬斯亮藍(lán)染色,結(jié)果表明IPTG誘導(dǎo)后,p20、p10以及p20p10蛋白大量表達(dá),在25kDa、14.4kDa以及45kD左右有明顯條帶;(3)親和層析法純化以上蛋白后,在包含Ac-WEHD-AMC的體系中不具有剪切活性;將上述蛋白純化前的裂解液上清加入體系中,結(jié)果顯示p20p10與p20p10(D381E)裂解液上清具備剪切活性;(4)以上瀉心湯單體成分中,Cop、Jatr以及Emodin對(duì)caspase-1的活性抑制率大于60%。Cop抑制效果最佳,IC_(50)=31.66±0.22μM;(5)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TLR-4以及MyD88蛋白表達(dá)升高,(1-30μM)黃連堿對(duì)其無(wú)明顯抑制作用;(6)黃連堿1-30μM對(duì)LPS和TLR-4的綁定無(wú)明顯作用,而小檗堿30μM,與報(bào)道相符,可顯著抑制該綁定;(7)IFN-γ(1000U)以及IFN-γ(1000U)+LPS(1μg/ml)均可刺激THP-1細(xì)胞釋放NO,高劑量Cop對(duì)其有一定的抑制作用。(8)皮下注射角叉菜膠引起大鼠足腫脹以及腫脹部位體表溫度升高,黃連堿3.87mg/kg顯著抑制大鼠足腫脹程度,同時(shí)顯著減少腫脹部位組織勻漿中NO和TNF-α的產(chǎn)量。結(jié)論:(1)三黃瀉心湯主要單體成分均對(duì)caspase-1剪切活性有不同程度的抑制作用,其中黃連堿的抑制作用最強(qiáng);(2)黃連堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞TLR-4和MyD88蛋白高表達(dá)無(wú)明顯抑制作用,對(duì)TLR-4與LPS綁定無(wú)影響;(3)黃連堿抑制IFN-γ以及IFN-γ+LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞NO釋放;(4)黃連堿對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足腫脹有明顯改善作用。
【學(xué)位單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文作為不溶蛋白分別構(gòu)建、表達(dá)、純化caspase大小亞基單一可溶性蛋白構(gòu)建、表達(dá)并純化全長(zhǎng)的caspase-1[40,4別在包涵體中表達(dá)時(shí)，需要再折疊后純化才能得到有剪樣的，表達(dá)全長(zhǎng)的caspase-1后也需要復(fù)性、純化從而在]。相反的，亦有文獻(xiàn)證實(shí)在純化caspase過(guò)程中可不用序[43]。由于caspase-1 p10亞基不穩(wěn)定，能自噬為p7，性失活，目前主要采用兩種方法抑制p10自噬，分別為酸鈉[44]以及對(duì)p10進(jìn)行點(diǎn)突變處理（D381E）[43]。通過(guò)，利用帶熒光標(biāo)簽的底物（如Ac-WEHD-AMC）可用于篩]。

成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文4見(jiàn)以下圖2、圖3：圖2：體外表達(dá)純化caspase-1蛋白技術(shù)路線圖，五角星代表關(guān)鍵步驟圖3：紅色五角星表示課題組前期實(shí)驗(yàn)已完成內(nèi)容，問(wèn)號(hào)表示本論文待解決問(wèn)題

成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文4見(jiàn)以下圖2、圖3：圖2：體外表達(dá)純化caspase-1蛋白技術(shù)路線圖，五角星代表關(guān)鍵步驟圖3：紅色五角星表示課題組前期實(shí)驗(yàn)已完成內(nèi)容，問(wèn)號(hào)表示本論文待解決問(wèn)題
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2894519