發(fā)布時(shí)間：2020-11-22 06:07

　　 目的:探討阿魏酸(Ferulic acid,FA)對(duì)小鼠腎缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。方法:將96只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為兩部分,第一部分做檢測(cè)實(shí)驗(yàn),將其隨機(jī)分為6組,每組6只,分別為:空白對(duì)照組(Control組)、阿魏酸對(duì)照組(FA組)、模型組(IR組),低劑量阿魏酸干預(yù)組(10 mg/kg FA+IR組)、中劑量阿魏酸干預(yù)組(30 mg/kg FA+IR組)、高劑量阿魏酸干預(yù)組(100 mg/kg FA+IR組)。模型組小鼠暴露雙側(cè)腎臟后,夾閉雙側(cè)腎蒂35 min,再灌24 h;空白對(duì)照組小鼠只暴露雙側(cè)腎臟,不夾閉腎蒂;低、中、高劑量的阿魏酸干預(yù)組小鼠,提前一天分別給予10、30、100 mg/kg阿魏酸灌胃,每8 h一次,連續(xù)灌胃3次進(jìn)行預(yù)處理后,再按模型組方法處理;阿魏酸對(duì)照組小鼠,提前一天給予100 mg/kg阿魏酸灌胃,每8 h一次,連續(xù)3次;然后各組小鼠同時(shí)處死,并取血及腎臟進(jìn)行檢測(cè)。第二部分小鼠用于七天生存率實(shí)驗(yàn),分組方法同第一部分,每組10只,按上述進(jìn)行腎臟暴露或阿魏酸預(yù)處理,模型組和低、中、高劑量的阿魏酸干預(yù)組小鼠的雙側(cè)腎蒂夾閉50min后,恢復(fù)灌注,每24 h觀察一次小鼠生存情況,并記錄,7 d后處死小鼠,繪制KM生存曲線。為了證明缺血誘導(dǎo)因子-1?(hypoxia inducible factor-1?,HIF-1?)在阿魏酸對(duì)小鼠腎缺血再灌注損傷中的作用,我們做了HIF-1?干擾實(shí)驗(yàn)。將12只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成兩組,HIF-1?干擾組:FA(100mg/kg)+Ad-HIF-1?siRNA+IR組和對(duì)照組:FA(100 mg/kg)+Ad-RFP+IR組。分別用Ad-HIF-1?siRNA或者Ad-RFP轉(zhuǎn)染雙腎,48 h后,給予100 mg/kg阿魏酸灌胃,每8 h一次,連續(xù)3次,然后按模型組方法處理后,取小鼠血及腎臟進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒檢測(cè)各組血肌酐(Serum creatine,Scr)、尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)含量;蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察腎臟病理變化情況,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移的UTP缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidly transferased UTP nick-end labeling,TUNEL)測(cè)定法檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡情況;半胱天冬酶-3(Caspase-3)活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)腎臟中Caspase-3水平;流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)和髓過(guò)氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)試劑盒檢測(cè)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)血清炎性介質(zhì)腫瘤壞死因子-?(tumor necrosis factor-?,TNF-?)和白細(xì)胞介素-1?(interleukin-1?,IL-1?)的表達(dá);高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)檢測(cè)腎臟組織中腺苷的含量;定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)和免疫印記法(western blot,WB)檢測(cè)腎臟組織中HIF-1?、CD39、CD73的表達(dá)。結(jié)果:1.與空白對(duì)照組相比,模型組小鼠7天生存率明顯下降,Scr、BUN水平顯著升高(P0.01),小鼠腎小管損傷程度明顯加重(P0.01)。2.與空白對(duì)照組相比,阿魏酸對(duì)照組的7天生存率、Scr、BUN水平、腎小管損傷程度、近曲腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況、Caspase-3活性、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況、促炎細(xì)胞因子TNF-?和IL-1?及HIF-1?、CD39、CD73在mRNA和蛋白水平表達(dá)上都無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.與模型組相比,低、中、高劑量的阿魏酸干預(yù)組Scr、BUN水平明顯降低,尤其是給藥劑量為100 mg/kg時(shí),Scr、BUN降低最明顯(P0.01);從KM生存曲線看,低、中、高劑量的阿魏酸干預(yù)組的7天生存率都提高,尤其是給藥劑量為100 mg/kg時(shí),7天生存率最高,因此選擇此劑量進(jìn)行后期的實(shí)驗(yàn)分析。4.與模型組相比,高劑量阿魏酸干預(yù)組小鼠近曲腎小管上皮細(xì)胞凋亡明顯減少,Caspase-3活性明顯降低(P0.01),中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少,促炎細(xì)胞因子TNF-?和IL-1?顯著減少(P0.01)。5.與模型組相比,高劑量阿魏酸干預(yù)組小鼠HIF-1?、CD39、CD73在mRNA和蛋白水平都明顯升高,腺苷產(chǎn)生也明顯增加(P0.01)。6.與FA(100 mg/kg)+Ad-RFP+IR組相比,FA(100 mg/kg)+Ad-HIF-1?siRNA+IR組小鼠HIF-1?、CD39、CD73減少,腺苷產(chǎn)生減少(P0.01),Scr、BUN水平顯著升高(P0.01),腎小管損傷程度明顯加重(P0.01)。結(jié)論:阿魏酸能提高腎缺血再灌注損傷小鼠的生存率,改善腎臟功能,減輕腎小管損傷,其可能機(jī)制是通過(guò)上調(diào)HIF-1?促進(jìn)內(nèi)源性腺苷產(chǎn)生,從而減輕炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文與- 亞基形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，通過(guò)結(jié)合缺氧標(biāo)基因[28-30]。HIF-1 可通過(guò)增加血管生成因子，促進(jìn)酵解的能力，調(diào)節(jié)對(duì)局部組織缺血和缺氧的適應(yīng)[31-37]。小鼠中，腎 IR 損傷明顯加重[38]。然而在用乙酰唑胺（的 AKI 的鼠模型中，Scr 和 BUN 水平下降，說(shuō)明 HIF-9]。同時(shí)，HIF- 還直接誘導(dǎo) CD73 的表達(dá)[40]，而 CD73。研究擬探討阿魏酸對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，腺苷的產(chǎn)生的相關(guān)機(jī)制。

27圖 2. 阿魏酸對(duì)腎 IR 小鼠的 存率及腎功 的改善作 （n=6）Effects of FA on survival rate and renal function in renal IR mice ( n=6 pe-day survival curve. (B) Scr levels. (C) BUN levels. All data were expresse#P<0.01 compared with control group,**P<0.01 compared with renal IR

圖 3 阿魏酸減輕腎 IR 小鼠的腎小管損傷和細(xì)胞凋亡（n=6）etreatment ameliorated renal structural damage and tubular cell aIR( n=6 per group)tative images of structure damage after renal IR on HE-stained k magnification 200. (B) Semiquantitative evaluation of kidney injuf apoptotic cells on TUNEL-stained kidney sections. (D) The caspas. All data were expressed as mean ±SD.##P<0.01 compared with**P<0.01 compared with renal IR model.減輕腎 IR 小鼠的炎癥反應(yīng)一步研究了阿魏酸在小鼠腎 IR 炎癥反應(yīng)中的作用。如圖組相比，阿魏酸對(duì)照組小鼠腎組織中的炎性細(xì)胞因子 IL-1
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