發(fā)布時間：2020-11-22 05:30

　　 阿膠是一味傳統(tǒng)中藥,在中國具有2000多年食用歷史。阿膠一直被公認為治病圣藥,曾被李時珍記入本草綱目譽為補血圣藥。阿膠主要由黑驢皮熬制而成,它的基本成分為膠原蛋白的降解產(chǎn)物。阿膠止血補血促進造血的功能已被廣泛接受。然而,阿膠對細胞,動物模型,人體免疫系統(tǒng)的藥理學機制沒有被報道過。我們都知道,在正常生理條件下,體內(nèi)細胞凋亡及細胞再生處于平衡狀態(tài),然而當細胞凋亡出現(xiàn)異常時,疾病就會伴隨發(fā)生。目前無論是細胞凋亡或是氧化應(yīng)激在臨床很多重大疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著極為重要的角色。例如敗血癥,它是由細菌等多種病原微生物感染引起的多器官功能性障礙疾病。目前臨床上對敗血癥的治療主要依賴抗生素及其他輔助治療措施,而這些手段往往因抗藥性和抗生素毒性及疾病復(fù)雜性等不能發(fā)揮很好的治療效果。敗血癥患者的免疫系統(tǒng)易發(fā)生氧化應(yīng)激和細胞凋亡;因此,本課題主要研究阿膠是否可以促進細胞培養(yǎng)物,小鼠敗血癥模型及人外周血單核細胞中氧化應(yīng)激的抗性,進而將阿膠用于臨床常見病的治療。首先,我們發(fā)現(xiàn)阿膠對體外培養(yǎng)的RAW264.7細胞無毒副作用;在無血清饑餓處理條件下,阿膠能促進體外培養(yǎng)細胞的分裂繁殖能力。其次,在氧化應(yīng)激壓力下,阿膠對RAW264.7細胞具有抗凋亡作用。為證明阿膠保護作用的普遍性,選擇其他免疫細胞和非免疫細胞進行實驗,我們發(fā)現(xiàn)阿膠這種保護作用具有免疫細胞特異性。蛋白水平的檢測結(jié)果表明阿膠能顯著降低Caspase-3和PARP1(Cas3的底物)等凋亡蛋白的表達量。此外,阿膠不僅能降低細胞內(nèi)ROS的水平同時也能改善線粒體膜功能。在百草枯誘導果蠅氧化應(yīng)激模型中,我們再次證明了阿膠的直接抗氧化應(yīng)激作用。在體內(nèi)為進一步驗證阿膠的抗凋亡作用,我們通過腹腔注射LPS建立小鼠敗血癥模型。通過DNA ladder實驗和TUNEL染色我們發(fā)現(xiàn)阿膠能顯著降低敗血癥小鼠免疫器官(胸腺和脾臟)細胞凋亡的數(shù)量。通過對血清中炎癥因子的ELISA檢測表明,在敗血癥早期阿膠能顯著提高抗炎性細胞因子IL-10的水平,使敗血癥小鼠積極抵抗炎癥反應(yīng)進一步降低促炎性細胞因子IL-1β;IL-6;TNF-α;HMGB1的水平,從而提高敗血癥小鼠的幸存率。最后,由于雙氧水刺激會造成人免疫細胞快速死亡,所以采用Etoposide、Staurosporine、LPSplusNigericin進行凋亡的誘導進而檢測阿膠對人免疫細胞(THP1cell和PBMCcell)的保護作用。通過Caspase3/7活性檢測,ATP檢測及凋亡蛋白PARP1的斷裂情況檢測,我們發(fā)現(xiàn)阿膠對人免疫細胞仍然具有抗凋亡的作用效果,且這種保護作用不隨凋亡誘導劑的變化而改變。敗血癥引起的細胞凋亡會通過不同方式影響宿主的免疫功能,例如免疫器官和免疫細胞的凋亡、免疫抑制、細胞因子大量表達等。此外,氧化應(yīng)激誘導的免疫細胞凋亡在衰老及輻射損傷誘導疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要作用。因此,阿膠作為一種免疫保護劑有望成為能應(yīng)用于臨床的抗凋亡藥物,進而治療多種由細胞凋亡和氧化應(yīng)激引起的疾病。
【學位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

伴隨著細胞程序性死亡的發(fā)生［２０－２３］。對于高等脊椎動物胚胎發(fā)育過程中，指間適??量的細胞凋亡扮演著十分重要的作用。此過程的細胞凋亡可以將手指彼此分開進而??增加手的靈便性和抓握能力（圖１．３Ａ）。當生物體在發(fā)育過程中為去除不再需要的??組織細胞時，也會對正常細胞進行可控的程序性死亡過程［２４］。如蝌蚪尾巴變態(tài)發(fā)??育過程；哺乳類雄性動物乳房器官的發(fā)育；果蠅發(fā)育過程中唾液腺的消失等（圖??１．３Ｂ）。多細胞生物在生長發(fā)育過程中往往會產(chǎn)生過多的細胞，山十機體內(nèi)細胞再??生和死亡處于平衡狀態(tài)，所以當細胞生產(chǎn)過量時就會發(fā)生細胞程序性死亡［２５］（閹??１．３Ｃｈ然而此過程一旦發(fā)生異�？赡馨殡S著腫瘤的發(fā)生，所以機體進行止常的細??胞程序性死亡是必要。當生物體受到外界不良環(huán)境的影響時，如輻射、紫外線、致??癌致畸等有害物質(zhì)刺激時就會對受損細胞啟動程序性死亡。除此以外，Ａ機體受到??細菌等多種病原微生物的感染時，免疫系統(tǒng)就會對病原微生物進行杵噬和清楚，Ａ??些免疫細胞存在過度免疫時機體也會對這部分細胞進行程序性死亡伯兮的激活。??這是竹椎動物對自身免疫調(diào)控的一種重要保護措施。??細胞死亡在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用??機體內(nèi)細胞死亡和細胞再生維持著動態(tài)平衡

圖１．４細胞不同的死亡方式（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ?ａｎｄ?Ｓｔｒａｓｓｅｒ，２００９）??Ｆｉｇ?１．４?Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｃｅｌｌ?ｄｅａｔｈ?ｍｅｔｈｏｄｓ．?（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ?ａｎｄ?Ｓｔｒａｓｓｅｒ，２００９）??隨后細胞核膜下的核纖層逐漸分解，核內(nèi)染色質(zhì)固縮成不均一的點狀結(jié)構(gòu)（圖１．４），??其主要原因是核酸內(nèi)切酶切斷了核小體間連接的ＤＮＡ，最終產(chǎn)生寡聚核小體片段，??其片段大小為１２０？１８０ｂｐ。ＤＮＡｌａｄｄｅｒ檢測時條帶呈梯狀分布。隨著細胞核的改變，??相鄰細胞間連接復(fù)合體消失；但此時，細胞膜的形狀仍保持完整，但細胞器（如高??爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）出現(xiàn)泡狀結(jié)構(gòu)與細胞膜融合并形成凋亡小體，其次核被膜也會膨??大等［３３，?３６］；形成的凋亡小體以出泡的形式離開正在死亡的細胞。凋亡小體很快就??會被周圍鄰近的巨噬細胞和間質(zhì)細胞吞噬，而不會引起周圍組織的炎癥反應(yīng)。細胞??發(fā)生凋亡時其自身的生化反應(yīng)也會發(fā)生改變。首先是鈣離子和蛋白激酶的改變：細??１４??

Ｃａｓｐａｓｅ－８單體以活性較弱的酶原形式存在，當被Ｆａｓ受體胞漿內(nèi)側(cè)的ＦＡＤＤ死亡??結(jié)構(gòu)域招募后，在胞漿局部達到一定的濃度后誘導自身激活從而激活細胞凋亡轉(zhuǎn)導??通路。此外，ＦＡＤＤ也能通過Ｃａｓｐａｓｅ－８直接活化Ｃａｓｐａｓｅ－３?（圖１．７）。??內(nèi)源性凋亡途徑：也稱為線粒體途徑或應(yīng)激性凋亡途徑，該途徑是通過激活??１６??
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本文編號：2894203