發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 14:04

　　 研究目的:急性骨骼肌損傷在運(yùn)動(dòng)損傷中較為常見,損傷骨骼肌有強(qiáng)大的自我修復(fù)能力,但纖維沉積的速度要快于肌肉再生,在損傷較為嚴(yán)重時(shí),骨骼肌會(huì)伴有纖維化的發(fā)生。本課題組前期研究也觀察到挫傷骨骼肌修復(fù)過程中存在纖維化現(xiàn)象,但機(jī)制尚不清楚。伴有纖維化的骨骼肌的生物力學(xué)特性較差,容易發(fā)生再次損傷,從而影響運(yùn)動(dòng)能力。因此我們建立了鈍挫傷骨骼肌纖維化模型。探究各種細(xì)胞因子包括:炎癥因子、趨化因子、氧化應(yīng)激因子、Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)因子和巨噬細(xì)胞在損傷骨骼肌修復(fù)過程中的表達(dá)規(guī)律與骨骼肌纖維化的關(guān)系。此外,我們還探究巨噬細(xì)胞和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)在損傷骨骼肌纖維化形成過程中的作用及可能關(guān)系。研究方法:40只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(C組,n=8)骨骼肌纖維化模型組(S,n=32)。在骨骼肌鈍挫傷后3d,6d,12d和24d取小鼠雙側(cè)腓腸肌。Masson三色染色觀察挫傷骨骼肌12天和24天膠原纖維的沉積情況。熒光定量PCR檢測(cè)炎癥因子、氧化應(yīng)激因子、趨化因子、巨噬細(xì)胞標(biāo)志物、Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)因子及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子m RNA的表達(dá)變化規(guī)律。免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)和巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80的表達(dá)和共定位情況。研究結(jié)果:1.挫傷骨骼肌修復(fù)過程中膠原纖維Masson染色及膠原蛋白熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果損傷12天和24天的小鼠骨骼肌組織對(duì)照組相比均有明顯的膠原纖維的沉積,即伴有不同程度的骨骼肌纖維化。且與第24天相比第12天膠原纖維的沉積量較高。熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析顯示,Ⅰ膠原蛋白COL1A1和Ⅲ型膠原蛋白COL3A1m RNA均在骨骼肌損傷的第3天和第6天與對(duì)照組相比顯著增加(p0.01),之后迅速下降。2.挫傷骨骼肌修復(fù)過程中TGF-β1與F4/80免疫熒光雙標(biāo)及熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比損傷后的第3天TGF-β1和F4/80的表達(dá)最高之后減少24天幾乎消失。同樣發(fā)現(xiàn)重合的黃色區(qū)域也是在損傷后的第3天和第6天較為顯著,隨后下降。說明骨骼肌損傷后的第3天和第6天巨噬細(xì)胞表達(dá)了TGF-β1且表達(dá)量較高。熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析顯示,TGF-β1m RNA也是在骨骼肌損傷的第3天、第6天和第12天表達(dá)量與對(duì)照組相比均顯著增加(p0.01)。巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80m RNA同樣在骨骼肌損傷的第3天和第6天表達(dá)顯著增加(p0.01),之后迅速下降。3.挫傷骨骼肌修復(fù)過程中趨化因子熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果熒光定量PCR測(cè)定了CC家族CXC家族趨化因子的趨化性,數(shù)據(jù)顯示,CCL2m RNA在骨骼肌損傷后第3天已經(jīng)開始顯著性升高(p0.01),隨后開始下降,但第6天與第12天對(duì)照組相比仍具有顯著性差異(p0.01)。CCL5m RNA在骨骼肌損傷后第3天顯著性增加(p0.01),第6天達(dá)到最高水平,隨后m RNA水平雖有下降,但與對(duì)照組相比,第12天仍顯著增加(p0.05)。CCR2m RNA在骨骼肌損傷后第3天顯著性增加(p0.01),隨后m RNA水平雖有下降,但第6天和第12天對(duì)照組相比,仍顯著增加(p0.01,p0.05)。CXCL12僅在傷后第3天表達(dá)與對(duì)照組相比顯著增加(p0.01),隨后迅速下降。CXCR4m RNA在傷后第3天,第6天表達(dá)與對(duì)照組相比均顯著增加(p0.01),第3天達(dá)到峰值隨后開始下降。4.挫傷骨骼肌修復(fù)過程中炎癥因子熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定了炎癥因子的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)顯示,炎癥因子TWEAK m RNA在骨骼肌損傷后第3天和第6天與對(duì)照組相比表達(dá)均顯著性增加(p0.01)。TWEAK受體Fin14在骨骼肌損傷后第3天表達(dá)顯著增加(p0.01),之后逐漸下降。5.挫傷骨骼肌修復(fù)過程中氧化應(yīng)激因子熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果熒光定量PCR結(jié)果顯示,氧化應(yīng)激因子gp91m RNA(NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基)在傷后第3天和第6天表達(dá)量與對(duì)照組相比均顯著增加,且在損傷后第3天達(dá)到峰值(p0.01),隨后開始下降。6.挫傷骨骼肌修復(fù)過程中Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)因子熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果熒光定量PCR的結(jié)果顯示Hes1m RNA在骨骼肌損傷后的第3天和第6天與對(duì)照組相比顯著增加。Hey1m RNA在骨骼肌損傷后的第3天和第6天也顯著增加,之后下降。Hey2m RNA僅在第12天與對(duì)照組相比有顯著增加。Hey Lm RNA僅在骨骼肌損傷的第6天顯著增加之后迅速下降。研究結(jié)論:(1)骨骼肌損傷修復(fù)過程中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1表達(dá)及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)過量增加可能對(duì)損傷骨骼肌纖維化的形成發(fā)揮重要作用。此外,骨骼肌修復(fù)期間,巨噬細(xì)胞分泌的TGF-β1可能促進(jìn)了損傷骨骼肌纖維化的發(fā)生。(2)挫傷骨骼肌纖維化形成過程中Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)因子Hes1,Hey1,Hey2,Hey L;炎癥因子TWEAK/Fn14;氧化應(yīng)激因子gp91-phox;趨化因子CCL2,CCL5,CCR2,CXCR4,CXCL12均高水平表達(dá),這些因子可能參與了損傷骨骼肌纖維化的形成。
【學(xué)位單位】：上海體育學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R87
【部分圖文】：

挫傷骨骼肌纖維化的發(fā)生機(jī)制研究3.材料與方法3.1 材料3.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組40只SPF級(jí)8周齡健康C57BL/6雄性小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司小鼠體重都約 18—25g。將 40 只小鼠隨機(jī)分為鈍挫傷纖維化模型組即 S 組(32 只和未損傷對(duì)照組即 C 組(8 只)。損傷纖維化模型組根據(jù)取材時(shí)間點(diǎn)不同分為3d,6d,12d,24d 四個(gè)組，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn) 8 只。3.1.2 技術(shù)路線

圖 2 損傷骨骼肌組織 Masson 三色染色結(jié)果比較膠原纖維、粘液、軟骨呈藍(lán)色；肌纖維、纖維素和紅細(xì)胞呈紅色；細(xì)胞核呈藍(lán)黑色損傷12天和24天的小鼠骨骼肌組織與對(duì)照組相比均有明顯的膠原纖維的沉積表明挫傷骨骼肌發(fā)生了纖維化。且與第 24 天相比第 12 天膠原纖維的沉積量較高。圖 3 損傷骨骼肌修復(fù)過程中膠原蛋白 mRNA 表達(dá)規(guī)律（與對(duì)照組相比，*p<0.05,**p<0.01）熒光定量 PCR 數(shù)據(jù)分析顯示，Ⅰ型膠原蛋白 COL1A1 和Ⅲ型膠原蛋白

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1 損傷骨骼肌修復(fù)過程中 Masson 三色染色結(jié)果及膠原蛋白 mRNA 表達(dá)圖 2 損傷骨骼肌組織 Masson 三色染色結(jié)果比較膠原纖維、粘液、軟骨呈藍(lán)色；肌纖維、纖維素和紅細(xì)胞呈紅色；細(xì)胞核呈藍(lán)黑色損傷12天和24天的小鼠骨骼肌組織與對(duì)照組相比均有明顯的膠原纖維的沉積表明挫傷骨骼肌發(fā)生了纖維化。且與第 24 天相比第 12 天膠原纖維的沉積量
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本文編號(hào)：2887590