研究背景:RCC是泌尿系統(tǒng)的常見(jiàn)惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅人類健康。最近的腎癌基因?qū)W研究結(jié)果揭示,腎癌本質(zhì)上是一種與代謝相關(guān)的疾病[2]。有研究顯示,伴有糖尿病的腎癌患者生存率低于無(wú)糖尿病的腎癌患者[3]。多年來(lái)國(guó)內(nèi)外均見(jiàn)糖尿病患者患癌率明顯高于非糖尿病患者的報(bào)道[4],并認(rèn)為糖尿病是引發(fā)癌癥發(fā)生和死亡的重要危險(xiǎn)因素之一[5],從而引起了相關(guān)研究領(lǐng)域國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。Cheng S等人[13]的最新研究表明MF可明顯提高局部腎癌患者的DFS和CSS。然而,另有研究顯示[14,15]糖尿病是腎癌患者預(yù)后的不良因素,MF對(duì)T2D并發(fā)腎癌患者生存結(jié)果無(wú)明顯改善作用。提示MF在細(xì)胞內(nèi)外不同糖環(huán)境下具有不同的藥理學(xué)效應(yīng)。眾所周知,MF是T2D一線降糖藥物,同時(shí)也是AMPK的激活劑。AMPK是細(xì)胞能量感受器,當(dāng)細(xì)胞缺乏能量時(shí)可促進(jìn)AMPK激活。腫瘤細(xì)胞常處于營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài),但在多種腫瘤細(xì)胞(含腎癌、乳腺癌、肺癌等)中卻表現(xiàn)為AMPK抑制[20]。現(xiàn)有多項(xiàng)體外研究發(fā)現(xiàn)MF能夠抑制前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、腎癌細(xì)胞的增殖[8-13]。最近的體內(nèi)外研究證實(shí),MF能夠通過(guò)激活A(yù)MPK、抑制m TOR通路,抑制腎細(xì)胞癌增殖、阻止RCC克隆體形成并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[16]。本研究的前期體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)低糖條件下MF可以促進(jìn)RCC細(xì)胞增殖,并同時(shí)出現(xiàn)AMPK的激活。因此我們分析,MF治療RCC預(yù)后不良的原因與細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)下對(duì)AMPK的影響有關(guān)。近幾年來(lái)PKM2在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子調(diào)節(jié)機(jī)制方面取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展,有報(bào)道顯示,PKM2核轉(zhuǎn)位可激活轉(zhuǎn)錄因子,在β-catenin靶基因c-Myc的表達(dá)中起重要作用,并促進(jìn)β-catenin介導(dǎo)的cyclin D1的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)細(xì)胞生存和增殖[19]。進(jìn)一步奠定了PKM2在調(diào)控腫瘤增殖環(huán)節(jié)中的重要位置。那么,低糖環(huán)境下MF引起的RCC細(xì)胞增殖是否與AMPK/PKM2信號(hào)通路有關(guān)?這引起了我們足夠的關(guān)注,但目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。目的:本研究將在低糖條件下探討MF對(duì)RCC細(xì)胞增殖的影響,闡明MF在低糖條件下促進(jìn)RCC細(xì)胞增殖的分子機(jī)制,為RCC臨床治療新策略的制定提供客觀的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。方法:首先應(yīng)用RCC細(xì)胞系A(chǔ)498和GRC-1細(xì)胞觀察MF在正�；虻吞菞l件下對(duì)RCC細(xì)胞增殖的影響:應(yīng)用MTT法和Brdu摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖;Western Blot法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)水平;行Western Blot檢測(cè)AMPK及p AMPK表達(dá)水平;應(yīng)用染色法觀察MF對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。隨后進(jìn)行MF在低糖條件下促進(jìn)RCC細(xì)胞增殖的機(jī)制研究:si RNA技術(shù)敲除A498細(xì)胞AMPK表達(dá)或使用AMPK抑制劑后研究MF在低糖培養(yǎng)條件下對(duì)RCC細(xì)胞代謝、增殖情況、增殖標(biāo)記物的表達(dá)情況、AMPK表達(dá)水平、β-catenin表達(dá)水平和PKM2表達(dá)水平的影響;si RNA敲除A498細(xì)胞β-catenin表達(dá)后研究MF在低糖培養(yǎng)條件下對(duì)RCC增殖情況、增殖標(biāo)記物的表達(dá)情況和PKM2表達(dá)水平的影響;行免疫共沉淀方法觀察低糖培養(yǎng)條件下,MF處理的RCC細(xì)胞AMPK、PKM2和β-catenin三者相互作用;應(yīng)用si RNA技術(shù)敲除A498細(xì)胞PKM2的表達(dá)或應(yīng)用PKM2抑制劑SKN后研究MF在低糖培養(yǎng)狀態(tài)下對(duì)A498細(xì)胞增殖情況、增殖標(biāo)記物的表達(dá)情況的影響。最后應(yīng)用動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究MF和SKN的抗腫瘤作用:應(yīng)用限制進(jìn)食、饑餓的方法模擬低糖狀態(tài),將8周齡BALB/C分為4組:對(duì)照組、MF組、SKN組、MF+SKN組,將1×106A498細(xì)胞接種于裸鼠,分別在腫瘤接種后5天、10天、15天和20天記錄腫瘤大小,同時(shí)觀察一般狀態(tài),第20天小鼠處死后取瘤拍照,測(cè)量腫瘤大小;應(yīng)用Western Blot方法和免疫組化方法觀察腫瘤組織Ki67的表達(dá)水平。結(jié)果:1、正常糖濃度培養(yǎng)條件下,MF抑制A498和GRC-1兩種RCC細(xì)胞的增殖;低糖培養(yǎng)條件下MF促進(jìn)A498和GRC-1兩種RCC細(xì)胞的增殖,并上調(diào)腫瘤增殖標(biāo)志物Ki-67的表達(dá),但對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)影響。2、正常糖濃度和低糖培養(yǎng)條件下,Western Blot結(jié)果顯示MF均可促進(jìn)AMPK磷酸化,且低糖條件與MF有協(xié)同增強(qiáng)AMPK磷酸化的作用。3、MF在正常糖濃度培養(yǎng)條件下降低RCC細(xì)胞的ATP和乳酸水平;在低糖培養(yǎng)條件下增加RCC細(xì)胞的ATP和乳酸水平(**,p0.01)。4、沉默AMPK后,低糖培養(yǎng)條件下MF誘導(dǎo)的RCC細(xì)胞ATP和乳酸水平增加的作用受到抑制(*,p0.05;**,p0.01)。Western Blot結(jié)果顯示低糖培養(yǎng)條件下MF誘導(dǎo)的低糖培養(yǎng)條件下MF誘導(dǎo)腫瘤增殖標(biāo)志物Ki-67表達(dá)上調(diào)的作用被抑制;MTT和Brdu結(jié)果顯示:低糖培養(yǎng)條件下MF誘導(dǎo)RCC細(xì)胞增殖的作用被抑制;q PCR結(jié)果顯示:低糖培養(yǎng)條件下MF誘導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖相關(guān)因子CCND1和c-Myc表達(dá)上調(diào)的作用被抑制(*,p0.05;**,p0.01)。5、低糖培養(yǎng)條件MF及AMPK聯(lián)合作用RCC細(xì)胞48h,MTT和Brdu結(jié)果顯示:AMPK抑制劑對(duì)低糖培養(yǎng)條件下MF誘導(dǎo)RCC細(xì)胞增殖的作用無(wú)影響(*,p0.05;**,p0.01),但MF誘導(dǎo)的RCC細(xì)胞ATP和乳酸水平增加的作用受到抑制(*,p0.05;**,p0.01)。6、低糖培養(yǎng)條件和MF作用下Western Blot檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核蛋白AMPK和β-catenin表達(dá)水平,細(xì)胞核內(nèi)AMPK和β-catenin表達(dá)水平增加,二者具有協(xié)同作用。7、Western Blot結(jié)果顯示:低糖培養(yǎng)條件下,敲除AMPK降低了MF誘導(dǎo)的RCC細(xì)胞AMPK和β-catenin核轉(zhuǎn)位;MF與AMPK抑制劑聯(lián)合應(yīng)用,對(duì)MF誘導(dǎo)的低糖條件下胞核AMPK和β-catenin表達(dá)水平無(wú)影響。8、Western Blot結(jié)果顯示,敲除β-catenin抑制了低糖條件下MF誘導(dǎo)的腫瘤增殖標(biāo)記物Ki-67表達(dá)的上調(diào);MTT和Brdu結(jié)果顯示:敲除β-catenin抑制了低糖條件下MF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖;q PCR結(jié)果顯示:敲除β-catenin抑制了MF誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖相關(guān)因子CCND1和c-Myc的m RNA水平上調(diào),二者具有協(xié)同作用。9、MF在低糖培養(yǎng)條件下Western Blot檢測(cè)顯示促進(jìn)A498細(xì)胞PKM2核轉(zhuǎn)位;敲除A498細(xì)胞中的AMPK表達(dá)后,細(xì)胞核內(nèi)PKM2表達(dá)水平降低。10、低糖培養(yǎng)條件下,MF促進(jìn)AMPK通過(guò)募集PKM2入核,促進(jìn)β-catenin核轉(zhuǎn)位并與β-catenin形成復(fù)合物;敲除AMPK或敲除PKM2均使MF促使的AMPK、PKM2和β-catenin的結(jié)合作用消失;敲除PKM2降低了MF作用下β-catenin的核轉(zhuǎn)位,但不影響MF作用下AMPK的核轉(zhuǎn)位。11、敲除A498細(xì)胞PKM2表達(dá),Western Blot結(jié)果顯示MF在低糖條件下誘導(dǎo)的腫瘤增殖標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)上調(diào)作用被抑制;MTT和Brdu結(jié)果顯示MF在低糖條件下誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖作用被抑制;q PCR結(jié)果顯示低糖培養(yǎng)條件下MF誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖相關(guān)因子CCND1和c-Myc的m RNA水平上調(diào)作用被抑制。12、PKM2抑制劑——紫草素(Shikonin,SKN)與MF低糖條件下共同作用,MTT和Brdu結(jié)果顯示:在SKN作用下,低糖條件MF誘導(dǎo)A498細(xì)胞增殖的作用被抑制;q PCR結(jié)果顯示:在SKN作用下,低糖條件MF誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖相關(guān)因子CCND1和c-Myc表達(dá)上調(diào)的作用被抑制。13、限制進(jìn)食、饑餓模擬低糖狀態(tài)下對(duì)接種RCC細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)有延緩效果,但無(wú)抑制效果。體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:低糖條件下,MF不能抑制腫瘤生長(zhǎng),而能夠提高腫瘤體積(1150mm3vs control 800mm3);SKN單獨(dú)(600mm3)或與MF聯(lián)合應(yīng)用(350mm3)能夠抑制腫瘤生長(zhǎng);抑制PKM2與MF聯(lián)合應(yīng)用抑制RCC增殖的效果優(yōu)于單獨(dú)抑制PKM2。Western Blot+免疫組化顯示:MF單獨(dú)應(yīng)用促進(jìn)腫瘤增殖,與SKN聯(lián)合應(yīng)用可抑制Ki-67的表達(dá)。結(jié)論:1.RCC細(xì)胞內(nèi)低糖條件下MF通過(guò)促進(jìn)AMPK募集PKM2入核促進(jìn)β-catenin核轉(zhuǎn)位并與β-catenin形成復(fù)合體,進(jìn)而促進(jìn)RCC細(xì)胞增殖;2.AMPK抑制劑的使用不影響上述過(guò)程,說(shuō)明MF在低糖條件下誘導(dǎo)RCC細(xì)胞的增殖不依賴于AMPK激酶活性;3.敲除PKM2可以抑制體外低糖培養(yǎng)條件下MF誘導(dǎo)的RCC細(xì)胞增殖,抑制PKM2可在體內(nèi)低糖狀態(tài)下逆轉(zhuǎn)MF誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖;4.裸鼠體內(nèi)抑制PKM2與MF聯(lián)合應(yīng)用抑制RCC增殖的效果優(yōu)于單獨(dú)抑制PKM2。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.11
【部分圖文】：
吉林大學(xué)博士學(xué)位論文培養(yǎng)板（2×104/孔），過(guò)夜貼壁后，加入 MF（3 mM）作用 24h 及 48 h，分別應(yīng)用 MTT 法和 Brdu 摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖。我們發(fā)現(xiàn)，在正常培養(yǎng)條件下，MF 抑制 A498 和 GRC-1 細(xì)胞的增殖，而低糖培養(yǎng)條件下，即使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，也觀察到了 MF 促進(jìn) RCC 增殖的作用（圖 2.1 A-B）。另外，我們還將 A498 細(xì)胞接種與 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（1×106/孔），過(guò)夜貼壁后，加入 MF（3 mM）作用 48 h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，行 Western Blot 檢測(cè)增殖 Marker Ki67 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在低糖培養(yǎng)條件下，MF 上調(diào) Ki67 的表達(dá)（圖 2.1 C）。
第 2 章 MF 在低糖條件下對(duì) RCC 細(xì)胞增殖影響的研究.4.2 MF 對(duì) RCC 細(xì)胞凋亡無(wú)影響為了觀察 MF 對(duì) RCC 凋亡的影響，將 A498 細(xì)胞和 GRC-1 接種與 96 孔細(xì)養(yǎng)板（2×104/孔），過(guò)夜貼壁后，加入 MF（3 mM）作用 24h 及 48 h，應(yīng)用法檢測(cè)觀察。我們發(fā)現(xiàn)，在正常培養(yǎng)條件及低糖培養(yǎng)條件下，MF 對(duì) A498RC-1 細(xì)胞凋亡均無(wú)影響（圖 2.2）。
圖 2.3 MF 對(duì) RCC AMPK 磷酸化的影響he effect of MF treatment on AMPK phosphoryexperiment was repeated for 3 times.metformin, MF）是分離自豆科植物 Galega offi件下的帶正電荷的親水性化合物，1957 年首和藥物管理局于 1994 年批準(zhǔn) MF 用于 T2D 治用極少，如低血糖、高胰島素血癥、維生素見(jiàn)乳酸性酸中毒，這些風(fēng)險(xiǎn)因素與與超重的糖低[27-30]。在某些情況下，胰島素似乎與促進(jìn)生尿病的一線降糖藥物[22,23]。T2D 的特征為肝
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本文編號(hào)：
2864034
