研究背景:RCC是泌尿系統(tǒng)的常見惡性腫瘤之一,嚴重威脅人類健康。最近的腎癌基因?qū)W研究結(jié)果揭示,腎癌本質(zhì)上是一種與代謝相關(guān)的疾病[2]。有研究顯示,伴有糖尿病的腎癌患者生存率低于無糖尿病的腎癌患者[3]。多年來國內(nèi)外均見糖尿病患者患癌率明顯高于非糖尿病患者的報道[4],并認為糖尿病是引發(fā)癌癥發(fā)生和死亡的重要危險因素之一[5],從而引起了相關(guān)研究領(lǐng)域國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。Cheng S等人[13]的最新研究表明MF可明顯提高局部腎癌患者的DFS和CSS。然而,另有研究顯示[14,15]糖尿病是腎癌患者預(yù)后的不良因素,MF對T2D并發(fā)腎癌患者生存結(jié)果無明顯改善作用。提示MF在細胞內(nèi)外不同糖環(huán)境下具有不同的藥理學(xué)效應(yīng)。眾所周知,MF是T2D一線降糖藥物,同時也是AMPK的激活劑。AMPK是細胞能量感受器,當(dāng)細胞缺乏能量時可促進AMPK激活。腫瘤細胞常處于營養(yǎng)缺乏狀態(tài),但在多種腫瘤細胞(含腎癌、乳腺癌、肺癌等)中卻表現(xiàn)為AMPK抑制[20]�，F(xiàn)有多項體外研究發(fā)現(xiàn)MF能夠抑制前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、腎癌細胞的增殖[8-13]。最近的體內(nèi)外研究證實,MF能夠通過激活A(yù)MPK、抑制m TOR通路,抑制腎細胞癌增殖、阻止RCC克隆體形成并誘導(dǎo)細胞周期阻滯[16]。本研究的前期體外細胞實驗發(fā)現(xiàn),細胞內(nèi)低糖條件下MF可以促進RCC細胞增殖,并同時出現(xiàn)AMPK的激活。因此我們分析,MF治療RCC預(yù)后不良的原因與細胞內(nèi)營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下對AMPK的影響有關(guān)。近幾年來PKM2在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的分子調(diào)節(jié)機制方面取得了實質(zhì)性的進展,有報道顯示,PKM2核轉(zhuǎn)位可激活轉(zhuǎn)錄因子,在β-catenin靶基因c-Myc的表達中起重要作用,并促進β-catenin介導(dǎo)的cyclin D1的轉(zhuǎn)錄,促進細胞生存和增殖[19]。進一步奠定了PKM2在調(diào)控腫瘤增殖環(huán)節(jié)中的重要位置。那么,低糖環(huán)境下MF引起的RCC細胞增殖是否與AMPK/PKM2信號通路有關(guān)?這引起了我們足夠的關(guān)注,但目前國內(nèi)外未見相關(guān)文獻報道。目的:本研究將在低糖條件下探討MF對RCC細胞增殖的影響,闡明MF在低糖條件下促進RCC細胞增殖的分子機制,為RCC臨床治療新策略的制定提供客觀的實驗室數(shù)據(jù)。方法:首先應(yīng)用RCC細胞系A(chǔ)498和GRC-1細胞觀察MF在正�；虻吞菞l件下對RCC細胞增殖的影響:應(yīng)用MTT法和Brdu摻入法檢測細胞增殖;Western Blot法檢測腫瘤細胞增殖標(biāo)志物Ki-67的表達水平;行Western Blot檢測AMPK及p AMPK表達水平;應(yīng)用染色法觀察MF對細胞凋亡的影響。隨后進行MF在低糖條件下促進RCC細胞增殖的機制研究:si RNA技術(shù)敲除A498細胞AMPK表達或使用AMPK抑制劑后研究MF在低糖培養(yǎng)條件下對RCC細胞代謝、增殖情況、增殖標(biāo)記物的表達情況、AMPK表達水平、β-catenin表達水平和PKM2表達水平的影響;si RNA敲除A498細胞β-catenin表達后研究MF在低糖培養(yǎng)條件下對RCC增殖情況、增殖標(biāo)記物的表達情況和PKM2表達水平的影響;行免疫共沉淀方法觀察低糖培養(yǎng)條件下,MF處理的RCC細胞AMPK、PKM2和β-catenin三者相互作用;應(yīng)用si RNA技術(shù)敲除A498細胞PKM2的表達或應(yīng)用PKM2抑制劑SKN后研究MF在低糖培養(yǎng)狀態(tài)下對A498細胞增殖情況、增殖標(biāo)記物的表達情況的影響。最后應(yīng)用動物體內(nèi)實驗進一步研究MF和SKN的抗腫瘤作用:應(yīng)用限制進食、饑餓的方法模擬低糖狀態(tài),將8周齡BALB/C分為4組:對照組、MF組、SKN組、MF+SKN組,將1×106A498細胞接種于裸鼠,分別在腫瘤接種后5天、10天、15天和20天記錄腫瘤大小,同時觀察一般狀態(tài),第20天小鼠處死后取瘤拍照,測量腫瘤大小;應(yīng)用Western Blot方法和免疫組化方法觀察腫瘤組織Ki67的表達水平。結(jié)果:1、正常糖濃度培養(yǎng)條件下,MF抑制A498和GRC-1兩種RCC細胞的增殖;低糖培養(yǎng)條件下MF促進A498和GRC-1兩種RCC細胞的增殖,并上調(diào)腫瘤增殖標(biāo)志物Ki-67的表達,但對細胞凋亡無影響。2、正常糖濃度和低糖培養(yǎng)條件下,Western Blot結(jié)果顯示MF均可促進AMPK磷酸化,且低糖條件與MF有協(xié)同增強AMPK磷酸化的作用。3、MF在正常糖濃度培養(yǎng)條件下降低RCC細胞的ATP和乳酸水平;在低糖培養(yǎng)條件下增加RCC細胞的ATP和乳酸水平(**,p0.01)。4、沉默AMPK后,低糖培養(yǎng)條件下MF誘導(dǎo)的RCC細胞ATP和乳酸水平增加的作用受到抑制(*,p0.05;**,p0.01)。Western Blot結(jié)果顯示低糖培養(yǎng)條件下MF誘導(dǎo)的低糖培養(yǎng)條件下MF誘導(dǎo)腫瘤增殖標(biāo)志物Ki-67表達上調(diào)的作用被抑制;MTT和Brdu結(jié)果顯示:低糖培養(yǎng)條件下MF誘導(dǎo)RCC細胞增殖的作用被抑制;q PCR結(jié)果顯示:低糖培養(yǎng)條件下MF誘導(dǎo)調(diào)節(jié)細胞增殖相關(guān)因子CCND1和c-Myc表達上調(diào)的作用被抑制(*,p0.05;**,p0.01)。5、低糖培養(yǎng)條件MF及AMPK聯(lián)合作用RCC細胞48h,MTT和Brdu結(jié)果顯示:AMPK抑制劑對低糖培養(yǎng)條件下MF誘導(dǎo)RCC細胞增殖的作用無影響(*,p0.05;**,p0.01),但MF誘導(dǎo)的RCC細胞ATP和乳酸水平增加的作用受到抑制(*,p0.05;**,p0.01)。6、低糖培養(yǎng)條件和MF作用下Western Blot檢測細胞質(zhì)及細胞核蛋白AMPK和β-catenin表達水平,細胞核內(nèi)AMPK和β-catenin表達水平增加,二者具有協(xié)同作用。7、Western Blot結(jié)果顯示:低糖培養(yǎng)條件下,敲除AMPK降低了MF誘導(dǎo)的RCC細胞AMPK和β-catenin核轉(zhuǎn)位;MF與AMPK抑制劑聯(lián)合應(yīng)用,對MF誘導(dǎo)的低糖條件下胞核AMPK和β-catenin表達水平無影響。8、Western Blot結(jié)果顯示,敲除β-catenin抑制了低糖條件下MF誘導(dǎo)的腫瘤增殖標(biāo)記物Ki-67表達的上調(diào);MTT和Brdu結(jié)果顯示:敲除β-catenin抑制了低糖條件下MF誘導(dǎo)的細胞增殖;q PCR結(jié)果顯示:敲除β-catenin抑制了MF誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)細胞增殖相關(guān)因子CCND1和c-Myc的m RNA水平上調(diào),二者具有協(xié)同作用。9、MF在低糖培養(yǎng)條件下Western Blot檢測顯示促進A498細胞PKM2核轉(zhuǎn)位;敲除A498細胞中的AMPK表達后,細胞核內(nèi)PKM2表達水平降低。10、低糖培養(yǎng)條件下,MF促進AMPK通過募集PKM2入核,促進β-catenin核轉(zhuǎn)位并與β-catenin形成復(fù)合物;敲除AMPK或敲除PKM2均使MF促使的AMPK、PKM2和β-catenin的結(jié)合作用消失;敲除PKM2降低了MF作用下β-catenin的核轉(zhuǎn)位,但不影響MF作用下AMPK的核轉(zhuǎn)位。11、敲除A498細胞PKM2表達,Western Blot結(jié)果顯示MF在低糖條件下誘導(dǎo)的腫瘤增殖標(biāo)志物Ki-67的表達上調(diào)作用被抑制;MTT和Brdu結(jié)果顯示MF在低糖條件下誘導(dǎo)的細胞增殖作用被抑制;q PCR結(jié)果顯示低糖培養(yǎng)條件下MF誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)細胞增殖相關(guān)因子CCND1和c-Myc的m RNA水平上調(diào)作用被抑制。12、PKM2抑制劑——紫草素(Shikonin,SKN)與MF低糖條件下共同作用,MTT和Brdu結(jié)果顯示:在SKN作用下,低糖條件MF誘導(dǎo)A498細胞增殖的作用被抑制;q PCR結(jié)果顯示:在SKN作用下,低糖條件MF誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)細胞增殖相關(guān)因子CCND1和c-Myc表達上調(diào)的作用被抑制。13、限制進食、饑餓模擬低糖狀態(tài)下對接種RCC細胞的裸鼠體內(nèi)腫瘤生長有延緩效果,但無抑制效果。體內(nèi)抑瘤實驗結(jié)果顯示:低糖條件下,MF不能抑制腫瘤生長,而能夠提高腫瘤體積(1150mm3vs control 800mm3);SKN單獨(600mm3)或與MF聯(lián)合應(yīng)用(350mm3)能夠抑制腫瘤生長;抑制PKM2與MF聯(lián)合應(yīng)用抑制RCC增殖的效果優(yōu)于單獨抑制PKM2。Western Blot+免疫組化顯示:MF單獨應(yīng)用促進腫瘤增殖,與SKN聯(lián)合應(yīng)用可抑制Ki-67的表達。結(jié)論:1.RCC細胞內(nèi)低糖條件下MF通過促進AMPK募集PKM2入核促進β-catenin核轉(zhuǎn)位并與β-catenin形成復(fù)合體,進而促進RCC細胞增殖;2.AMPK抑制劑的使用不影響上述過程,說明MF在低糖條件下誘導(dǎo)RCC細胞的增殖不依賴于AMPK激酶活性;3.敲除PKM2可以抑制體外低糖培養(yǎng)條件下MF誘導(dǎo)的RCC細胞增殖,抑制PKM2可在體內(nèi)低糖狀態(tài)下逆轉(zhuǎn)MF誘導(dǎo)的腫瘤細胞增殖;4.裸鼠體內(nèi)抑制PKM2與MF聯(lián)合應(yīng)用抑制RCC增殖的效果優(yōu)于單獨抑制PKM2。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.11
【部分圖文】：
吉林大學(xué)博士學(xué)位論文培養(yǎng)板（2×104/孔），過夜貼壁后，加入 MF（3 mM）作用 24h 及 48 h，分別應(yīng)用 MTT 法和 Brdu 摻入法檢測細胞增殖。我們發(fā)現(xiàn)，在正常培養(yǎng)條件下，MF 抑制 A498 和 GRC-1 細胞的增殖，而低糖培養(yǎng)條件下，即使腫瘤細胞生長緩慢，也觀察到了 MF 促進 RCC 增殖的作用（圖 2.1 A-B）。另外，我們還將 A498 細胞接種與 6 孔細胞培養(yǎng)板（1×106/孔），過夜貼壁后，加入 MF（3 mM）作用 48 h，收集細胞，提取細胞總蛋白，行 Western Blot 檢測增殖 Marker Ki67 表達水平，發(fā)現(xiàn)在低糖培養(yǎng)條件下，MF 上調(diào) Ki67 的表達（圖 2.1 C）。
第 2 章 MF 在低糖條件下對 RCC 細胞增殖影響的研究.4.2 MF 對 RCC 細胞凋亡無影響為了觀察 MF 對 RCC 凋亡的影響，將 A498 細胞和 GRC-1 接種與 96 孔細養(yǎng)板（2×104/孔），過夜貼壁后，加入 MF（3 mM）作用 24h 及 48 h，應(yīng)用法檢測觀察。我們發(fā)現(xiàn)，在正常培養(yǎng)條件及低糖培養(yǎng)條件下，MF 對 A498RC-1 細胞凋亡均無影響（圖 2.2）。
圖 2.3 MF 對 RCC AMPK 磷酸化的影響he effect of MF treatment on AMPK phosphoryexperiment was repeated for 3 times.metformin, MF）是分離自豆科植物 Galega offi件下的帶正電荷的親水性化合物，1957 年首和藥物管理局于 1994 年批準 MF 用于 T2D 治用極少，如低血糖、高胰島素血癥、維生素見乳酸性酸中毒，這些風(fēng)險因素與與超重的糖低[27-30]。在某些情況下，胰島素似乎與促進生尿病的一線降糖藥物[22,23]。T2D 的特征為肝
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本文編號：
2864034
