發(fā)布時(shí)間：2020-10-31 13:04

　　 研究背景:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(system lupus srythematosus,SLE)可累及全身多個(gè)器官,包括腎臟、皮膚、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等等。狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡最常見(jiàn)的并發(fā)癥。根據(jù)南京軍區(qū)總醫(yī)院統(tǒng)計(jì),繼發(fā)性腎小球腎炎中狼瘡腎炎占54.3%~([1])。30%-50%的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者在疾病早期即出現(xiàn)腎病綜合征、急進(jìn)性腎炎、尿液檢查異常等腎臟損害的臨床表現(xiàn),其中以急進(jìn)性腎炎為表現(xiàn)者腎功能損傷最重。南京總醫(yī)院解放軍腎臟病研究所統(tǒng)計(jì)1352例狼瘡性腎炎的臨床與免疫學(xué)特征,總計(jì)17.5%出現(xiàn)急性腎功能衰竭;國(guó)外臨床數(shù)據(jù)提示表現(xiàn)為急進(jìn)性腎炎者達(dá)到30%。狼瘡性腎炎患者出現(xiàn)快速的腎功能丟失的常見(jiàn)原因有:(1)形成彌漫性的細(xì)胞性的新月體;(2)大量血栓堵塞毛細(xì)血管襻;(3)狼瘡性腎血管病變,如血栓性微血管病;(4)急性間質(zhì)性腎炎;(5)腎靜脈血栓,偶見(jiàn)腎動(dòng)脈血栓。如活動(dòng)性病變未得到有效控制,患者可進(jìn)入慢性腎功能不全甚至尿毒癥,而這部分病人的腎臟病理類型常常是IV型或IV型伴V型。狼瘡性腎炎有多種病理類型,其中IV型為彌漫性狼瘡性腎炎,超過(guò)50%腎小球受累。根據(jù)病變活動(dòng)程度,累及的病變范圍,以及增生病變?cè)诿��?xì)血管內(nèi)或外等特點(diǎn)又可以做進(jìn)一步的描述。目前認(rèn)為狼瘡性腎炎的發(fā)病機(jī)制涉及到遺傳背景、環(huán)境因素、性激素代謝異常、Treg數(shù)量減少、B細(xì)胞異常增殖活化、自身抗體生成、補(bǔ)體異�；罨�以及免疫復(fù)合物腎臟內(nèi)沉積等諸多因素,有非常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。有研究者發(fā)現(xiàn)IgG1和IgG3在以增殖性為主的腎炎中通過(guò)經(jīng)典和替代兩條途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)~([2]);而V型狼瘡性腎炎中IgG以IgG4為主,主要通過(guò)替代途徑活化補(bǔ)體~([3])。盡管如此,狼瘡性腎炎的發(fā)病機(jī)制仍未能夠完全闡明。KDIGO指南要求狼瘡性腎炎均需要做腎臟穿刺活檢,根據(jù)腎臟病理特點(diǎn)確定治療方案~([4])。特別是腎臟活檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞性新月體的時(shí)候,意味著快速的腎功能衰竭正在發(fā)生。此時(shí)如不給予大劑量糖皮質(zhì)激素或環(huán)磷酰胺沖擊誘導(dǎo)治療,錯(cuò)過(guò)有限的最佳治療時(shí)間窗,細(xì)胞性新月體纖維化之后,腎功能衰竭將難以恢復(fù)。但由于腎臟活檢的有創(chuàng)性,并不能頻繁的安排狼瘡性腎炎患者進(jìn)行定期活檢評(píng)估腎臟病理情況。因此,我們需要尋找可靠的生物標(biāo)志物用于無(wú)創(chuàng)性診斷和長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)、評(píng)估是否出現(xiàn)威脅性極大的IV型狼瘡性腎炎以及細(xì)胞性新月體的病理情況。miRNAs在腎臟的內(nèi)穩(wěn)態(tài)和疾病進(jìn)程中有重要作用~([5,6])。miRNA從細(xì)胞中釋放到尿液中,可以結(jié)合RNA結(jié)合蛋白或打包進(jìn)外泌體~([7–9])。隨著體液活檢在近年來(lái)的快速發(fā)展,外泌體miRNA作為多種疾病診斷的生物標(biāo)志物引起了越來(lái)越多的關(guān)注。外泌體是直徑30-120nm的小囊泡,存在于包括血液、尿液、唾液、乳汁、腦脊液等在內(nèi)的幾乎所有的生物體液中~([10–13])。外泌體作為一種細(xì)胞外囊泡的亞型,區(qū)別于其他囊泡的特點(diǎn)在于它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的生物學(xué)來(lái)源不同:成熟的多泡體融合細(xì)胞膜去釋放外泌體到細(xì)胞外空間。外泌體包含miRNA、lncRNA、mRNA和蛋白質(zhì)等~([14,15]),將生物學(xué)信息從來(lái)源細(xì)胞傳遞到靶細(xì)胞。腎單位的所有細(xì)胞均能分泌外泌體~([15][16])。它能準(zhǔn)確的表現(xiàn)腎功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷,被認(rèn)為是傳播信息的重要途徑~([17])。因此,尿外泌體運(yùn)載的miRNA可作為潛在的生物標(biāo)志物的用于腎臟疾病的診斷和預(yù)后~([18,19])。尿液miRNAs有來(lái)自于循環(huán)中通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)的miRNAs,但更多的是源于腎單位外泌體運(yùn)載的富含腎臟特定信息的miRNAs~([20,21])。這一發(fā)現(xiàn)和研究進(jìn)展使得臨床上對(duì)持續(xù)動(dòng)態(tài)觀察狼瘡性腎炎患者腎臟病理的演變,評(píng)估病情進(jìn)展成為可能,對(duì)狼瘡性腎炎的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究和臨床相關(guān)疾病的治療產(chǎn)生重大的影響。近期的研究證實(shí),尿液外泌體miRNAs表達(dá)譜在局灶節(jié)段性腎小球硬化和微小病變腎病的患者中有155個(gè)miRNAs表達(dá)有差異~([22]),miR-145在I型糖尿病腎病尿液外泌體中富集而II型糖尿病腎病患者與健康人尿液外泌體相比有16個(gè)miRNAs表達(dá)有差異~([23,24])。miR-29c在尿液外泌體中的表達(dá)水平可預(yù)測(cè)狼瘡性腎炎的早期纖維化~([25])。這就提示我們:尿液外泌體miRNA表達(dá)譜的改變準(zhǔn)確的反映了在該腎病的病理生理特點(diǎn),為我們打開(kāi)一扇持續(xù)監(jiān)測(cè)腎臟病理改變新的窗戶,為研究腎臟病理機(jī)制和早期診斷和治療指明的新的方向。目的:在本研究中,我們從活動(dòng)性的IV型狼瘡性腎炎伴細(xì)胞性新月體、活動(dòng)性的IV型狼瘡性腎炎不伴細(xì)胞性新月體、非活動(dòng)性IV性狼瘡性腎炎以及健康人的晨尿外泌體中入手,探索尿液外泌體miRNA表達(dá)譜在各組之間的表達(dá)特點(diǎn)及調(diào)控關(guān)系,尋找IV型狼瘡性腎炎及細(xì)胞性新月體的新的生物標(biāo)志物。方法:1.樣本來(lái)源及分組:所有狼瘡性腎炎病人于2016年1月-2018年1月在大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科就診,均接受腎臟活檢明確病理分型并確定是否伴有細(xì)胞性新月體。健康志愿者來(lái)源于該醫(yī)院體檢中心,在研究中作為對(duì)照組。健康人定義為沒(méi)有狼瘡、乙肝、糖尿病、高血壓等系統(tǒng)性疾病,腎功能或eGFR正常,沒(méi)有血尿、蛋白尿或白細(xì)胞尿。遵照2008年修訂的《赫爾辛基宣言》,該研究方案經(jīng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有受試者已簽署書(shū)面知情同意書(shū),留取晨尿100ml并在1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行處理;2.提取尿液外泌體采用超高速離心法從尿液中提取外泌體:初步離心2500g,30min以去除細(xì)胞和殘?jiān)?在4℃下17000g離心30min去除大囊泡;超高速離心機(jī)4℃下200000g離心70min,去除上清液得到初步顆�；�的外泌體;再次超高速離心機(jī)4℃下200000g離心70min得到顆�；�的外泌體,加入PBS存入-80℃冰箱待用;3.透射電子顯微鏡檢測(cè)使用透射電鏡檢測(cè)外泌體形態(tài)和直徑,確認(rèn)外泌體外觀特征。取出-80℃冰箱待用的外泌體并加入PBS重懸浮。在封口膜上滴一滴大約30ul的外泌體懸浮液,并將銅網(wǎng)膜面置于每一滴外泌體懸浮液上面,懸浮吸附約10分鐘,用濾紙緩慢吸干。轉(zhuǎn)移銅網(wǎng)至1%醋酸雙氧鈾染液(1克醋酸雙氧鈾溶于100ML雙蒸水配制而成)液滴上,染色10分鐘,用濾紙緩慢吸干。轉(zhuǎn)移銅網(wǎng)到雙蒸水液滴上,3次,每次2分鐘,用濾紙吸干。待其在自然晾干后,日本電子透射電子顯微鏡(型號(hào):JEM-1400/JEM-1400 PLUS,日本產(chǎn))觀察:使用電壓:100KV,在熒光屏中低倍找到觀察的區(qū)域,插入CCD(gatan公司,型號(hào):830)觀察、尋找外泌體、調(diào)試電鏡至圖像清晰,采集需要的圖像。4.外泌體粒徑分布檢測(cè)使用ZETASIZER Nano series-Nano-ZS檢測(cè)外泌體粒徑分布。經(jīng)過(guò)前面步驟提取得到的外泌體用PBS重懸浮。按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范上機(jī)檢測(cè):ZETASIZER Nano series-Nano-ZS。獲得的粒徑分布圖見(jiàn)后文附圖。5.流式細(xì)胞儀表面標(biāo)記物檢測(cè)取出-80℃冰箱待用的外泌體并加入PBS重懸浮。取兩份樣品(編號(hào)DCX、HSF)一部分使用不染色外泌體作為陰性對(duì)照,標(biāo)記為NC;另一部分分別進(jìn)行CD63和CD81兩組抗體染色,標(biāo)記為CD63和CD81。按照儀器操作規(guī)程上機(jī)檢測(cè):BD accuri C6 flow cytomenter。6.Western blot檢測(cè)通過(guò)Western blot檢測(cè)CD9、CD81等外泌體表明標(biāo)志是否存在,非外泌體表面標(biāo)志Calnexin是否存在。尿液外泌體溶解在RIPA緩沖液中,然后離心12000g,15分鐘,收集上清液并且轉(zhuǎn)運(yùn)到新的EP管里。等量的可溶性總蛋白在8%的SDS-PAGE(Life Technologies,USA)電泳并且轉(zhuǎn)運(yùn)到一個(gè)PVDF膜上分析每個(gè)樣品。使用CD9兔抗(1:1000)和CD81兔抗(1:1000),還有非外泌體標(biāo)志物的Calnexin鼠多克隆抗體(1:1000)作為一抗孵育。之后選擇辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗。使用化學(xué)發(fā)光試劑盒(Beyotime,Shanghai,China)和X射線膠片曝光。7.高通量測(cè)序通過(guò)Illumina HiSeq~(TM) 2500測(cè)序,得到各組的miRNA表達(dá)譜,并根據(jù)計(jì)算出表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的miRNAs。對(duì)于sRNA測(cè)序?qū)嶒?yàn),從總RNA提取到最終的cDNA文庫(kù)制備完成主要包括以下步驟:總RNA分別連接5`接頭盒3`接頭;第一鏈cDNA合成然后PCR擴(kuò)增;通過(guò)凝膠電泳法得到cDNA文庫(kù);上機(jī)測(cè)序。測(cè)序所得到的初步序列集合還需要進(jìn)一步處理:排除污染、低質(zhì)量的序列,并且去除兩端的接頭之后,得到clean reads。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比,可以對(duì)其中所包含的各種sRNA的構(gòu)成和各自的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和注解。未能在已有數(shù)據(jù)庫(kù)中找到對(duì)應(yīng)注釋的片段可以進(jìn)行新的miRNA的預(yù)測(cè)。8.Heatmap聚類分析通過(guò)Multi Experiment Viewer(V4.9.0)軟件,選擇進(jìn)行Gene Tree和Sapmle Tree的HCL Analysis,采用Optimize Gene Leaf Order和Optimize Sample Leaf Order,選擇紅藍(lán)色調(diào)和調(diào)整數(shù)據(jù)顯示格式后得到:IV型狼瘡性腎炎與健康人之間的Heatmap;活動(dòng)性IV型狼瘡性腎炎與非活動(dòng)性IV型狼瘡性腎炎之間的Heatmanp;活動(dòng)性IV型狼瘡性腎炎與健康人之間的Heatmanp;活動(dòng)性的IV型狼瘡性腎炎伴細(xì)胞性新月體與活動(dòng)性的IV型狼瘡性腎炎不伴細(xì)胞性新月體之間的Heatmap。9.Volcano plot圖譜分析通過(guò)E Chart輸入上述各組的測(cè)序數(shù)據(jù),分析并得到Volcano plot圖譜,顯示出尿液外泌體miRNAs的表達(dá)量分布圖和|Fc|高低,展示出IV狼瘡性腎炎與健康人群的尿液外泌體miRNA的表達(dá)差異;IV狼瘡性腎炎活動(dòng)狀態(tài)與非活動(dòng)狀態(tài)的尿液外泌體miRNA的表達(dá)差異;活動(dòng)性IV型狼瘡性腎炎中有細(xì)胞性新月體與無(wú)細(xì)胞性新月體之間的尿液外泌體miRNA的表達(dá)差異;10.差異miRNAs的通路分析使用DIANA miRPath(V3.0)對(duì)以上各組間顯著差異的miRNAs進(jìn)行通路分析,探尋不同病理情況下差異表達(dá)的miRNAs可能涉及到的信號(hào)通路。通過(guò)對(duì)TargetScan、Tarbase7.0、microT-CDS(v5.0)等3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的DIANA-mirPath結(jié)果取交集,并排除腫瘤、乙肝、白血病、甲狀腺激素相關(guān)的通路之后,得到以下與IV型LN以及細(xì)胞性新月體相關(guān)的通路,p值以及作用的基因和miRNAs;11.TF預(yù)測(cè)利用JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)中各模型的PSSM(Position-Specific Scoring Matrices)矩陣進(jìn)行TF(transcription factor)預(yù)測(cè);使用賓夕法尼亞大學(xué)計(jì)算生物學(xué)及信息學(xué)實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的TESS軟件根據(jù)TF結(jié)合部位在基因組中分布的不平衡性,應(yīng)用權(quán)重矩陣數(shù)據(jù)庫(kù)搜索TF的結(jié)合部位;用FIMO(Find Individual Motif Occurrence)軟件包利用已知motif的MEME(Multiple EM for Motif Elicitation)矩陣搜索序列中潛在的motif的匹配位點(diǎn)。綜合上述三個(gè)預(yù)測(cè)軟件得到的TF的預(yù)測(cè)結(jié)果,并將三種方法都可預(yù)測(cè)到的TF作為候選TF;12.miRNA的靶基因預(yù)測(cè)通過(guò)TargetScan,miRDB,miRTarBase和miRWalk這四個(gè)預(yù)測(cè)軟件對(duì)IV狼瘡性腎炎與健康人群的尿液外泌體的表達(dá)差異miRNA、IV狼瘡性腎炎活動(dòng)狀態(tài)與非活動(dòng)狀態(tài)的尿液外泌體的表達(dá)差異miRNA、IV型狼瘡性腎炎伴與不伴細(xì)胞性新月體兩組之間差異miRNAs的作用靶點(diǎn)進(jìn)行分析,綜合上訴四個(gè)預(yù)測(cè)軟件得到的miRNA靶基因結(jié)果,并將多種算法預(yù)測(cè)的結(jié)果和實(shí)驗(yàn)證實(shí)的結(jié)果取交集,作為各組間差異miRNAs的候選靶基因;13.TF-miRNAs-mRNA網(wǎng)絡(luò)分析綜合上述候選TF、miRNAs和miRNAs的候選靶基因,按照TF和miRNA的結(jié)合關(guān)系,miRNA與基因間的靶向調(diào)控關(guān)系,用Cytoscape建立以miRNA為基礎(chǔ)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),包括轉(zhuǎn)錄因子、miRNAs、mRNA和相互作用的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)TF-miRNAs-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖,可以直觀的了解以miRNA為中心的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),并根據(jù)其上游和下游節(jié)點(diǎn)鏈接數(shù)量Degree評(píng)分,篩選出影響最大的重要miRNA;結(jié)合臨床標(biāo)本高通量測(cè)序結(jié)果的各組間差異表達(dá)分析,進(jìn)一步篩選出下一步研究的候選miRNAs;14.RT-qPCR驗(yàn)證建立驗(yàn)證組并驗(yàn)證候選miRNA:收集活動(dòng)性的IV型狼瘡性腎炎伴細(xì)胞性新月體10例、活動(dòng)性的IV型狼瘡性腎炎不伴細(xì)胞性新月體10例、非活動(dòng)性IV性狼瘡性腎炎10例以及健康人10例的晨尿100mlPCR驗(yàn)證其表達(dá)量,并確證測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。選定的3個(gè)miRNAs(miR-3135b,miR-654-5p,miR-146a-5p)進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。將尿液外泌體樣本從-80攝氏度儲(chǔ)存環(huán)境中取出并置于冰上,加PBS重懸浮,2500g離心20分鐘,轉(zhuǎn)移上清液至新管,放冰上,提取RNA后用Qubit 3.0檢測(cè)樣本RNA濃度,并加入外參cel-miR-39-3p的mimic(10uM)1ul,渦旋混勻,-80攝氏度保存。cDNA反轉(zhuǎn)錄:以樣品提取的總RNA為模板,建立包括RT Mix,RT primer(C)(10uM),RNA template,ddH_2O的反應(yīng)體系,混勻后離心收集液體至管底,42℃*60分鐘,72攝氏度*10分鐘,產(chǎn)物即為cDNA模板。定量PCR:建立包括RNase-free H_2O,Forward primer(10uM),Reverse primer(10uM),SYBR Green Surpermix,cDNA模板的反應(yīng)體系,進(jìn)行PCR擴(kuò)增并制作溶解曲線:70℃至95℃之間,每0.5℃讀版一次并停5s。15.ROC分析根據(jù)RT-qPCR的結(jié)果確認(rèn)測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠,使用SPSS(V.19.0.0)進(jìn)行ROC分析篩選出的miR-3135b、miR-654-5p和miR-146a-5p的表達(dá)量,計(jì)算AUC、尤登指數(shù)和p值等,分別計(jì)算這3個(gè)miRNA對(duì)IV型狼瘡性腎炎伴細(xì)胞性新月體的診斷敏感性和特異性。結(jié)論:1.按照研究計(jì)劃收集活動(dòng)性/非活動(dòng)性/伴有細(xì)胞性新月體/無(wú)細(xì)胞性新月體等各種特點(diǎn)的IV型狼瘡性腎炎患者和健康人晨尿,并采用超高速離心法提取人尿液外泌體。采用透射電子顯微鏡、ZETASIZER Nano series-Nano-ZS、流式細(xì)胞儀、Western blot等多種方法評(píng)估所獲得的外泌體的整體形態(tài)、粒徑分布、特異性表面標(biāo)志是否存在及其分布比例,證實(shí)并優(yōu)化尿液外泌體獲取質(zhì)量。2.通過(guò)對(duì)尿液外泌體miRNA進(jìn)行高通量測(cè)序,在活動(dòng)性IV型狼瘡伴有新月體、IV型狼瘡無(wú)新月體,非活動(dòng)性IV型LN及健康人組等各組比較中得到了差異表達(dá)的miRNA;3.分析這組間差異表達(dá)的miRNAs,得到了IV型狼瘡性腎炎中與細(xì)胞性新月體相關(guān)的15條信號(hào)通路;4.基于多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)了候選TF和mRNA,建立了以miRNA為基礎(chǔ),包括TF、miRNA和mRNA和他們之間的相互關(guān)系的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò);5.選出3個(gè)miRNAs(miR-3135b,miR-654-5p,miR-146a-5p)用RT-qPCR的方法在IV型狼瘡伴有新月體、IV型狼瘡無(wú)新月體,非活動(dòng)性IV型LN及健康人中驗(yàn)證,并繪制了ROC曲線,發(fā)現(xiàn)miR-3135b和miR-654-5p能區(qū)分IV型狼瘡性腎炎伴或不伴細(xì)胞性新月體,其AUC波動(dòng)在0.910-0.911(p0.001)。6.綜上:這些結(jié)果表明IV型LN中細(xì)胞性新月體的形成涉及到復(fù)雜的信號(hào)通路和調(diào)控網(wǎng)絡(luò),尿液外泌體miR-3135b和miR-654-5p可以作為診斷IV型狼瘡性腎炎是否伴細(xì)胞性新月體的生物標(biāo)志物。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R593.242
【部分圖文】：

32圖 1 為外泌體標(biāo)本 DCX 和 HSF 在儀器 ZETASIZER Nano series-Nano-ZS 上進(jìn)行粒徑分布分析所得的原始測(cè)量數(shù)據(jù)。

33圖 2 為外泌體標(biāo)本 60502531 和 7000055410 在儀器 ZETASIZER Nano series-Nano-ZS 上進(jìn)行粒徑分布分析所得的原始測(cè)量數(shù)據(jù)。

外泌體標(biāo)本 DCX 與 HSF 經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析后自動(dòng)生成得到的關(guān)鍵數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表數(shù)（PDI），根據(jù)累積距法得到的分布系數(shù)是一個(gè)無(wú)量綱的值，代表粒子尺表適中分散度體系，是運(yùn)算法則最佳適用范圍。
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10 陳書(shū)芬,劉志紅,陳惠萍,周虹,王建平,胡偉新,黎磊石;激素及環(huán)磷酰胺沖擊治療對(duì)新月體腎炎腎小球趨化因子的影響[J];腎臟病與透析腎移植雜志;2001年06期

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1 李羿;Ⅳ型狼瘡性腎炎伴細(xì)胞性新月體的尿液外泌體miRNA表達(dá)譜分析[D];中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

2 周悅玲;IgA腎病進(jìn)展至ESRD風(fēng)險(xiǎn)模型的驗(yàn)證與新模型建立[D];上海交通大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 蔡方豪;新月體分型對(duì)增殖型狼瘡性腎炎預(yù)后的聯(lián)系與意義[D];浙江大學(xué);2016年

2 金玫萍;437例原發(fā)性IgA腎病臨床與病理特點(diǎn)及其相關(guān)性分析[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

3 劉興花;40例狼瘡性腎炎患者臨床與病理分析[D];山西醫(yī)科大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2863981