發(fā)布時(shí)間：2020-10-30 11:52

　　 目的:檢測并驗(yàn)證體外正常糖、高糖、高糖+VX-765(caspase-1抑制劑)培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞(人近端腎小管上皮細(xì)胞)circRNA差異表達(dá)譜,探索可能參與糖尿病腎病腎小管間質(zhì)病變炎癥及焦亡發(fā)病機(jī)制的circRNAs。方法:體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞分為3組:正常糖組、高糖組,高糖+VX-765組,同步培養(yǎng)24小時(shí)后trizol提取總RNA。采用Arraystar Human circRNA Array V2芯片檢測3組細(xì)胞circRNA的表達(dá)水平,Agilent Feature Extraction軟件(版本11.0.1.1)分析采集的陣列圖像,R軟件limma軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理。通過表達(dá)倍數(shù)變化(fold change2)確定3組細(xì)胞間差異表達(dá)的circRNAs,通過分層聚類區(qū)分3組細(xì)胞間circRNAs的表達(dá)模式,使用基于Target Scan和miRanda的miRNA靶標(biāo)預(yù)測軟件預(yù)測可能與circRNA相互作用的microRNA。最后根據(jù)表達(dá)倍數(shù)及表達(dá)量由大到小選擇滿足在高糖VS正常糖組上調(diào),同時(shí)在高糖+VX-765 VS高糖組中下調(diào)及在高糖VS正常糖組下調(diào),同時(shí)在高糖+VX-765 VS高糖組中上調(diào)的circRNAs各5個(gè)進(jìn)行后續(xù)qRT-PCR驗(yàn)證及生物信息學(xué)分析。結(jié)合文獻(xiàn)初步探討可能參與糖尿病腎病腎小管間質(zhì)病變炎癥及焦亡發(fā)病機(jī)制中的circRNAs。結(jié)果:1.circRNA芯片結(jié)果顯示高糖組與正常糖組相比,表達(dá)上調(diào)的circRNAs共92個(gè),表達(dá)下調(diào)的circRNA共25個(gè),其中上調(diào)最顯著的是hsa_circRNA_402294(7.0299804倍),下調(diào)最顯著的是hsa_circ RNA_001906(-22.9722809倍)。高糖+VX-765組與高糖組相比,表達(dá)上調(diào)的circRNA共有54個(gè),表達(dá)下調(diào)的circRNA共有103個(gè),其中上調(diào)最顯著的是hsa_circRNA_404975(100.4332781倍),下調(diào)最顯著的是hsa_circRNA_103142(-21.0658222倍)。2.caspase-1抑制劑(VX-765)可抑制54個(gè)circRNAs在高糖狀態(tài)下的高表達(dá)、14個(gè)circRNAs在高糖狀態(tài)下的低表達(dá)。這些circRNAs可能參與糖尿病腎小管間質(zhì)的炎癥及焦亡病變。3.hsa_circRNA_102747,hsa_circRNA_405650,hsa_circRNA_104854經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證在三組細(xì)胞間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義4.每個(gè)circRNA均有詳細(xì)的注釋信息,均有按照與其競爭結(jié)合強(qiáng)弱關(guān)系排序的5個(gè)microRNAs,可進(jìn)行后續(xù)ceRNA機(jī)制分析或其他功能機(jī)制探討。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞,高糖組與正常糖組相比circRNAs譜異常表達(dá),高糖組中加入caspase-1抑制劑(VX-765)后circRNAs表達(dá)譜與高糖組相比又發(fā)生顯著改變。circRNAs可能參與糖尿病腎病腎小管間質(zhì)病變,可能與炎癥及焦亡機(jī)制有關(guān)。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R587.2;R692.9
【部分圖文】：

用 Agilent G2505CG2505C 掃描雜交后的芯片，結(jié)果如圖 1 所示，均勻、清晰，沒有邊緣化效應(yīng)、刮傷等影響信號值，陽性定位點(diǎn)和區(qū)域明顯，說明芯片結(jié)果可用。正常糖組 高糖組 高糖+VX-765圖1 芯片掃描圖過箱式圖（Box Plot）分析，如圖2所示�？梢杂^察到三組樣品cir密度值經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化后平均值接近在一個(gè)水平上，數(shù)據(jù)中間的50%范高，數(shù)據(jù)基本符合正態(tài)分布。

位對照區(qū)域明顯，說明芯片結(jié)果可用。正常糖組 高糖組 高糖+VX-765 組圖1 芯片掃描圖通過箱式圖（Box Plot）分析，如圖2所示�？梢杂^察到三組樣品circRNA原始熒光密度值經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化后平均值接近在一個(gè)水平上，數(shù)據(jù)中間的50%范圍值一致性較高，數(shù)據(jù)基本符合正態(tài)分布。圖2 Box Plot-circRNA通過散點(diǎn)圖（Scatter Plot）分析，如圖3所示，可直觀看到兩組間芯片表達(dá)數(shù)據(jù)的分布變化，觀察到兩樣品數(shù)據(jù)總體分布集中趨勢。本實(shí)驗(yàn)選擇circRNA的

Foldchange＞2.0。圖3 Scatter Plot-cirRNA通過分層聚類分析，如圖4所示，證實(shí)三組樣品均為同類，可直觀的看出三組細(xì)胞中同一circRNA相對表達(dá)量高低情況。紅色代表相對高表達(dá)，綠色、藍(lán)色代表相對低表達(dá)。圖4 高糖組、正常糖組、高糖+VX-765組中差異circRNA的分層聚類熱圖
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本文編號：2862436