細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞老化是一個(gè)不可避免的現(xiàn)象。延緩細(xì)胞老化過程,提高細(xì)胞傳代過程中的活力,對(duì)于永生化細(xì)胞獲得,干細(xì)胞傳代以及轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的篩選具有重要意義。自噬是細(xì)胞內(nèi)自我修復(fù)的機(jī)制之一,保持細(xì)胞代謝的均衡,并參與細(xì)胞老化等細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的過程。研究證明自噬在延緩細(xì)胞老化方面起重要作用。在老化進(jìn)程中自噬水平下降,且自噬下降會(huì)加速老化進(jìn)程,同時(shí)自噬水平升高可以延緩老化的速度。改善自噬水平延緩細(xì)胞老化已成為一個(gè)熱點(diǎn)科學(xué)問題,受到各國(guó)科學(xué)者們的重視,對(duì)細(xì)胞遺傳資源保護(hù)以及改善與老化相關(guān)疾病都具有重要意義。雷帕霉素是一種免疫抑制劑,可以抑制mTOR,誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生。本研究利用雷帕霉素處理成年牛皮膚成纖維細(xì)胞,旨在通過促進(jìn)細(xì)胞自噬,改善成體成纖維細(xì)胞老化的現(xiàn)象,延長(zhǎng)細(xì)胞壽命,以期保護(hù)其遺傳資源,同時(shí)也為核移植等提供理想的生物學(xué)材料。本研究對(duì)于傳代到第13代發(fā)生老化的成年牛成纖維細(xì)胞用雷帕霉素(RAPA)進(jìn)行處理。檢測(cè)與細(xì)胞老化有關(guān)基因CDKN2A、CDKN1A的表達(dá)以及β-半乳糖苷酶(β-gal)的活性,觀察了細(xì)胞內(nèi)自噬小體形態(tài)的變化,并通過轉(zhuǎn)染pEX-GFP-hLC3 WT質(zhì)粒觀察細(xì)胞中...

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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圖1-1:細(xì)胞自噬的形成過程

自噬過程的發(fā)生經(jīng)歷了四個(gè)階段,自噬泡的初始產(chǎn)生、自噬體的形成、自噬的轉(zhuǎn)運(yùn)融合、自噬的降解(Jinetal.2014)。自噬泡的形成:在外界刺激因子作用下,在細(xì)胞內(nèi)受損的線粒體等物質(zhì)周圍有杯狀形的雙層膜結(jié)構(gòu)初步形成。自噬體的形成:自噬過程始于細(xì)胞質(zhì)成分的隔離,其中細(xì)胞質(zhì)的某些部....

圖1-2:雷帕霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

雷帕霉素的化學(xué)分子式為C51H79NO13,分子量914.172g/mol,熔點(diǎn)為183-185℃,為白色固體結(jié)晶,親脂性,溶解于有機(jī)溶劑,極微溶于水,幾乎不溶于乙醚。1.4.2雷帕霉素作用機(jī)制

圖1-3:細(xì)胞mTOR信號(hào)通路

現(xiàn)已被科學(xué)家發(fā)現(xiàn),雷帕霉素能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬作用(吳伯艷等2015)11。研究表明,雷帕霉素能在體內(nèi)和體外通過抑制靶蛋白(mTOR)激酶的活性從而激活細(xì)胞自噬(Graziottoetal.2012;Garrattetal.2016)。雷帕霉素與FK506結(jié)合蛋白12形成復(fù)....

圖2-1 P1與P14成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

第一代的牛皮膚成纖維細(xì)胞和第14代的成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)趨勢(shì)均符合細(xì)胞體外生長(zhǎng)的一般規(guī)律,都為S形曲線。第1-3天為潛伏期,細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢;第3-5天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,數(shù)量明顯增多;5天之后細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期,基本不再生長(zhǎng)。繪制兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,結(jié)果顯示,與P1細(xì)胞相比,P14....

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