由于異源抗體在寵物臨床治療中易引起宿主免疫排斥反應,因此制備基于本動物源的基因工程抗體顯示了更大的發(fā)展優(yōu)勢和前景。為制備H3N2亞型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)的重組犬源化抗體scFv-Fc,采集CIV感染犬外周血淋巴細胞提取總RNA,利用PCR技術擴增IgG重鏈(VH)、輕鏈(VL)和Fc片段。利用重疊延伸PCR將VH和VL通過彈性肽鏈linker連接成單鏈抗體(scFv)片段,并轉化大腸桿菌,挑取陽性菌測序。經(jīng)分析篩選后,將目標scFv與Fc片段鏈接,構建scFv-Fc重組犬源抗體片段。經(jīng)誘導表達,獲得分子量約為50 kD的scFv和約為89 kD的重組抗體scFv-Fc�？贵w活性測定結果表明,scFv能與CIV特異性結合,1 mg/mL scFv的ELISA效價為1∶2¹⁰,血凝抑制(HI)效價為1∶2⁷,中和抗體效價為1∶20。1 mg/mL scFv-Fc的HI效價為1∶2⁶,ELISA效價1∶2⁵,中和抗體效價為1∶20。本研究成功制備了針對H3N2...

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【文章目錄】：
材料與方法
    1 毒株、質(zhì)粒及細胞系
    2 主要試劑
    3 實驗動物及CIV感染
    4 外周血淋巴細胞RNA的提取及反轉錄
    5 克隆及鑒定可變區(qū)基因
        5.1 引物的設計與合成
        5.2 VH、VL及Fc基因的克隆
    6 克隆及鑒定單鏈抗體基因
        6.1 引物設計與合成
        6.2 克隆單鏈抗體及Fc基因
    7 表達與鑒定單鏈抗體scfv和Fc片段
        7.1 構建pET-32a-scFv、pET-32a-Fc和pET-32a-scFv-Fc重組表達載體
        7.2 誘導表達scFv、Fc和scFv-Fc蛋白
        7.3 蛋白純化及Western Blot鑒定
        7.4 血凝抑制活性檢測
        7.5 ELISA檢測
        7.6 微量中和試驗
結果
    1克隆可變區(qū)基因與擴增單鏈抗體基因
    2重組蛋白scFv、Fc和scFv-Fc的純化及鑒定
    3 scFv及scFv-Fc蛋白的血凝抑制效價
    4間接ELISA測定scFv及scFv-Fc的活性
    5 scFv與scFv-Fc的中和效價
討論



本文編號：3996099