發(fā)布時(shí)間：2024-06-02 04:21

　　牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis)又稱壞死性鼻炎(necrotic rhinitis),是由牛皰疹病毒Ⅰ型(Bovine Herpesvirus 1,BHV-1)感染野生和家養(yǎng)牛引起的一種接觸性傳染病,呈全球分布,該病可引起上呼吸道感染,其特征為鼻部出現(xiàn)粘液膿涕,口鼻部充血,呼吸困難,以及生殖道感染,結(jié)膜炎,流產(chǎn),乳房炎等多種病癥。牛呼吸道合胞病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)感染可以引起犢牛呼吸道疾病,也可以與其它病原混合感染引起牛的呼吸道疾病。主要危害是此病感染率高,占牛流行性呼吸道疾病中的60%以上,給養(yǎng)牛業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。鑒于此,本研究以BHV-1基因缺失毒株TK-/gG-/gE-為載體,構(gòu)建表達(dá)BRSV主要免疫原性蛋白G基因的牛BHV-1重組病毒,對(duì)其生物學(xué)特性、安全性進(jìn)行了研究。具體研究?jī)?nèi)容如下:(1)BRSVG蛋白的原核表達(dá)將BRSVG基因196-774bp(mG)連入pET-30a原核表達(dá)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-mG原核表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表...

【文章頁(yè)數(shù)】：61 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略表(Abbreviations)
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 牛呼吸道合胞病毒
    1.2 牛呼吸道合胞病毒編碼的蛋白
        1.2.1 非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2
        1.2.2 疏水SH小蛋白
        1.2.3 糖蛋白G
        1.2.4 融合F蛋白
    1.3 牛呼吸道合胞病毒的流行病學(xué)
    1.4 牛呼吸道合胞病毒疫苗的研究進(jìn)展
        1.4.1 滅活疫苗
        1.4.2 亞單位合成疫苗
        1.4.3 活病毒疫苗
        1.4.4 病毒載體活疫苗
        1.4.5 DNA疫苗
    1.5 BHV-1病毒的概述
    1.6 BHV-1的流行病學(xué)
    1.7 BHV-1病毒活載體疫苗的研究進(jìn)展
2 研究目的與意義
3 材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌種、細(xì)胞及毒株
        3.1.2 載體與質(zhì)粒
        3.1.3 工具酶及主要試劑
        3.1.4 主要培養(yǎng)基的配制
        3.1.5 主要緩沖液
            3.1.5.1 質(zhì)粒提取緩沖液
            3.1.5.2 SDS-PAGE電泳緩沖液
            3.1.5.3 Western blot緩沖液
            3.1.5.4 蛋白純化緩沖液
        3.1.6 空斑純化試劑
        3.1.7 ELISA緩沖液
        3.1.8 其他溶液
        3.1.9 本研究所用引物
        3.1.10 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)地點(diǎn)
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 病毒增殖
        3.2.2 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
        3.2.3 PCR或酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)
        3.2.4 PCR或酶切產(chǎn)物的回收與純化
        3.2.5 外源DNA片段與載體的連接反應(yīng)
        3.2.6 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法)
        3.2.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.2.8 重組質(zhì)粒的小量制備(OMEGA質(zhì)粒小提試劑盒)
        3.2.9 重組質(zhì)粒的大量制備(OMEGA質(zhì)粒大提試劑盒)
        3.2.10 誘導(dǎo)表達(dá)
        3.2.11 表達(dá)蛋白的分析和純化
        3.2.12 表達(dá)蛋白的多抗制備
        3.2.13 間接ELISA確定表達(dá)蛋白的最佳包被濃度
        3.2.14 病毒基因組的大量提取
        3.2.15 脂質(zhì)體介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)染
        3.2.16 空斑挑取及純化
        3.2.17 病毒基因的小量提取
        3.2.18 病毒基因組PCR鑒定
        3.2.19 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)
        3.2.20 Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)
            3.2.20.1 樣品的處理
            3.2.20.2 SDS-PAGE電泳
            3.2.20.3 Western blot檢測(cè)
        3.2.21 病毒TCID50的測(cè)定
        3.2.22 一步法增殖曲線
        3.2.23 動(dòng)物試驗(yàn)
            3.2.23.1 重組牛皰疹病毒BHV-1TK^-/gG^-/gE^-/BRSVG⁺的動(dòng)物試驗(yàn)
            3.2.23.2 動(dòng)物試驗(yàn)鼻拭子的檢測(cè)
            3.2.23.3 動(dòng)物試驗(yàn)血清ELISA抗體檢測(cè)
            3.2.23.4 動(dòng)物試驗(yàn)血清中和抗體檢測(cè)
4 結(jié)果與分析
    4.1 BRSV G基因的原核表達(dá)以及間接ELISA抗原最佳包被濃度的確定
        4.1.1 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-mG的構(gòu)建
        4.1.2 BRSV mG蛋白的原核表達(dá)
        4.1.3 mG蛋白的純化
        4.1.4 mG蛋白的westernblot鑒定
        4.1.5 兔多抗的制備及檢測(cè)
        4.1.6 mG-ELISA檢測(cè)確定mG蛋白的最佳包被濃度
    4.2 重組病毒BHV-1TK^-/gG^-/gE^-/BSRVG⁺的構(gòu)建
        4.2.1 中間轉(zhuǎn)移載體pSK-b actin-BGH-CMV-SV40的構(gòu)建
        4.2.2 轉(zhuǎn)移載體pSKBgEpCA.G的構(gòu)建
        4.2.3 重組病毒BHV-1TK^-/gG^-/gE^-/BSRVG⁺的構(gòu)建與初步鑒定
        4.2.4 重組病毒BHV-1 TK^-/gG^-/gE^-/BRSVG⁺的PCR鑒定與空斑純化
        4.2.5 重組病毒BHV-1 TK^-/gG^-/gE^-/BRSVG⁺外源基因表達(dá)的檢測(cè)
            4.2.5.1 重組病毒BHV-1 TK^-/gG^-/gE^-/BRSVG⁺的間接免疫熒光檢測(cè)
            4.2.5.2 重組病毒BHV-1 TK^-/gG^-/gE^-/BRSVG⁺的western blot檢測(cè)
        4.2.6 重組病毒BHV-1 TK^-/gG^-/gE^-/BRSVG⁺的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)
        4.2.7 重組病毒BHV-1 TK^-/gG^-/gE^-/BRSVG⁺一步法生長(zhǎng)曲線
    4.3 重組病毒BHV-1 TK^-/gG^-/gE^-/BRSVG+免疫原性的初步研究
        4.3.1 兔鼻拭子的排毒情況檢測(cè)
        4.3.2 ELISA檢測(cè)兔血清中的BRSV抗體水平
        4.3.3 中和試驗(yàn)檢測(cè)兔血清中的BHV-1中和抗體水平
5 討論與結(jié)論
    5.1 討論
        5.1.1 BRSV.G蛋白的表達(dá)
        5.1.2 皰疹病毒Ⅰ型載體的選擇
        5.1.3 重組病毒的構(gòu)建和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
    5.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3986847