發(fā)布時間：2020-11-21 19:14

　　 在哺乳動物妊娠期,胎盤是調(diào)節(jié)宮內(nèi)環(huán)境和保障胎兒發(fā)育的重要媒介,其中胎盤的血管網(wǎng)發(fā)揮了關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)提高妊娠期日糧中蛋氨酸水平能夠提高仔豬初生窩重和仔豬初生個體重,然而蛋氨酸調(diào)控胎盤血管發(fā)育的作用及其調(diào)控機(jī)理尚不清楚。本研究以豬血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象,構(gòu)建了豬胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型,研究了蛋氨酸對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的調(diào)控規(guī)律;并進(jìn)一步從關(guān)鍵基因表達(dá)調(diào)控角度,研究蛋氨酸調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞血管生成關(guān)鍵基因的關(guān)鍵機(jī)制。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.提高蛋氨酸水平對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響。通過建立豬血管內(nèi)皮細(xì)胞與豬滋養(yǎng)層細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型,研究在豬血管內(nèi)皮細(xì)胞單獨培養(yǎng)和與豬胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)條件下,將蛋氨酸從生理濃度(0.05mmol/L)提高到0.2和0.5 mmol/L對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響。結(jié)果顯示,在單獨培養(yǎng)或者共培養(yǎng)條件下,提高蛋氨酸的水平都顯著促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的成管(P0.05),但是蛋氨酸與培養(yǎng)條件不存在交互作用,說明了蛋氨酸促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成不依賴于滋養(yǎng)層細(xì)胞。2.提高蛋氨酸水平影響豬血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的主要事件。提高蛋氨酸水平后內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔數(shù)、總的分支長度和總的節(jié)點數(shù)顯著增加(P0.05)。通過MTT法和流式細(xì)胞術(shù),檢測不同濃度蛋氨酸處理對細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果表明,隨著蛋氨酸濃度的增加,細(xì)胞活力顯著增加(P0.05),但是對細(xì)胞周期沒有影響。細(xì)胞劃痕和Transwell小室遷移法檢測提高蛋氨酸水平對細(xì)胞遷移能力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著蛋氨酸濃度增加,細(xì)胞的遷移能力顯著增加(P0.05),說明了提高蛋氨酸水平主要影響了內(nèi)皮細(xì)胞血管生成中的細(xì)胞遷移事件。3.蛋氨酸對內(nèi)皮細(xì)胞血管生成關(guān)鍵基因的調(diào)控。對細(xì)胞遷移基因和血管生成相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化檢測發(fā)現(xiàn),增加蛋氨酸水平(0.05mmol/L Vs0.5mmol/L)對MMP2的mRNA表達(dá)沒有影響,但是顯著增加了MMP9、VEGF-A、VEGF120、VEGF164、VEGFR-1的mRNA水平(P0.05),血管生成負(fù)調(diào)節(jié)基因sVEGFR-1的表達(dá)量也顯著增加(P0.05)。在0.5mmol/L蛋氨酸處理條件下,檢測蛋氨酸不同處理時間對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞VEGF-A的mRNA表達(dá)的變化,結(jié)果表明隨著蛋氨酸處理時間的增加,VEGF-A的mRNA表達(dá)水平逐漸增加,當(dāng)處理時間達(dá)到24h時,顯著促進(jìn)了VEGF-A mRNA的表達(dá)(P0.05)。此外,蛋氨酸不同處理時間或不同濃度蛋氨酸對豬胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞VEGF-A的mRNA表達(dá)沒有影響。4.VEGF-A在介導(dǎo)提高蛋氨酸水平促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成中的作用。本試驗利用VEGF-A抑制劑Bevacizumab對細(xì)胞進(jìn)行處理,研究了VEGF-A在介導(dǎo)提高蛋氨酸水平促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成中的作用。結(jié)果表明,與高濃度蛋氨酸處理組相比,添加Bevacizumab處理后的細(xì)胞遷移能力顯著降低(P0.05),而與生理濃度蛋氨酸相比沒有顯著性差異。在血管生成試驗中,添加Bevacizumab處理后形成管腔數(shù)、總的分支長度和總的節(jié)點數(shù)與高濃度蛋氨酸處理組相比顯著降低(P0.05);與生理濃度蛋氨酸相比,總的分支長度仍顯著增加(P0.05),總的節(jié)點數(shù)無顯著差異。說明了在豬血管內(nèi)皮細(xì)胞中,VEGF-A在介導(dǎo)蛋氨酸促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。5.蛋氨酸調(diào)控VEGF-A基因表達(dá)機(jī)制的研究。VEGF-A的mRNA水平增加涉及到轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。本試驗通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)來探究蛋氨酸對RNA聚合酶Ⅱ與VEGF-A基因CDS區(qū)的結(jié)合能力的影響。結(jié)果表明,在高蛋氨酸水平下,RNA聚合酶Ⅱ與VEGF-A基因啟動子結(jié)合沒有顯著變化。利用放線菌素D進(jìn)行處理,當(dāng)處理時間增加到30和60min時,高蛋氨酸處理組VEGF-A的mRNA穩(wěn)定性顯著高于低蛋氨酸處理組(P0.05)。說明了,提高蛋氨酸不影響VEGF-A轉(zhuǎn)錄水平,而是通過提高VEGF-A mRNA轉(zhuǎn)錄后的穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)的。綜上所述,本研究的結(jié)論是:1.提高蛋氨酸水平促進(jìn)了豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管生成,但該作用不依賴于滋養(yǎng)層細(xì)胞。2.蛋氨酸促進(jìn)豬血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成是通過提高VEGF-A基因表達(dá)來實現(xiàn)的。3.蛋氨酸通過影響了VEGF-A mRNA轉(zhuǎn)錄后的穩(wěn)定性提高了VEGF-A的mRNA水平。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S828.5
【部分圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文絨毛膜胎盤、上皮絨毛膜胎盤、內(nèi)皮絨毛膜胎盤和結(jié)締絨毛膜胎ding and Burton 2008）。母豬妊娠期形成的上皮絨毛膜胎盤，胎兒與母體營養(yǎng)物質(zhì)的交換需要經(jīng)過六層組織層數(shù)，包括胎兒面的胎盤血管內(nèi)皮細(xì)盤基質(zhì)結(jié)締組織層、胎盤絨毛上皮層，母體面的母體子宮內(nèi)膜上皮層、結(jié)締組織層、母體血管內(nèi)皮細(xì)胞層（Renfree et al 1982；楊倩等 2008）（。在豬整個妊娠期，胎盤絨毛膜外側(cè)的滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞都未嵌入子宮內(nèi)(Corner et al 1921；Anderson et al 1976)，所有的絨毛膜與子宮粘膜緊密有侵入，也沒有破壞子宮粘膜，最終形成了彌散型上皮絨毛膜胎盤(Co21；Burton et al 2008；Cristofolinni et al 2017)。

圖 1-2 母豬胎盤的胎兒和母體血管（引自 Leiser et al 1988）（MA，母體動脈；MAI，母體微動脈；FA，胎兒動脈；FAI，胎兒微動脈；FV，胎兒脈；FVI，胎兒微靜脈）Fig 1-2 Maternal and fetal vessel cast of pig placenta（Leiser et al 1988）（MA, maternal artery; Mal, maternal arteriole; FA, fetal artery; FAI, fetal arteriole; FV, fetal veFVl, fetal venule）2.2 豬胎盤發(fā)育規(guī)律對大多數(shù)家畜物種來說，在胚胎發(fā)育過程中，從受精卵到囊胚的大多數(shù)階是相似的（King et al 1993；Roberts et al 2008）。隨后，由于母體與胎兒之間相作用方式的不同，將一個物種與另一個物種區(qū)分開來（Hyttle et al 1990；Ramial 2016）。與其他物種不同的是，豬妊娠期所形成的胎盤屏障更薄，擴(kuò)散距離更

用于維持胎兒生長需要。血管生成形成的成熟血管網(wǎng)絡(luò)主要是通過兩種血管生長方式來完成的（如圖1-4）：（1）在原有血管基礎(chǔ)上以非分枝的方式生長，包括血管伸長和嵌入。這種方式通過在血管的末端進(jìn)行縱向生長，使毛細(xì)血管增長，并增加血管的連接點和分支之間的距離來增加毛細(xì)血管袢（Demir et al 2007）。（2）以分枝的方式進(jìn)行血管生長，包括出芽和血管套疊。這種血管生長能夠增加血管分枝以及形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。出芽是血管生成中極為重要的生長方式，包括血管的內(nèi)皮細(xì)胞降解基底膜，增殖并遷移到周圍的結(jié)締組織中，內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)，這種血管生成的方式能夠形成多個毛細(xì)血管。血管套疊能夠在原有血管腔內(nèi)陷形成管腔內(nèi)的組織柱樣結(jié)構(gòu)，進(jìn)而形成新的毛細(xì)血管。這個過程使一個血管分枝形成兩個，最終形成并行的毛細(xì)血管（Kaufmann et al 2004；Charnock et al 2004）。與此同時，內(nèi)皮生長出來的新血管穩(wěn)定發(fā)育成動脈或靜脈過程中，會募集血管周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞來共同維持血管的穩(wěn)定。（Mayhew et al 2004；Kay et al 2011；Wang et al 2017）。圖 1-4：血管生成模式圖（修改自 Juan et al 2008；Kay et al 2011 ）Fig.1-4 Modes of angiogenesis (Modified from Juan et al 2008; Kay et al 2011)
【參考文獻(xiàn)】

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