發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 23:35

　　 單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenges,Lm)簡(jiǎn)稱單增李斯特菌,屬革蘭氏陽性菌,是WHO劃定的重要食源性病原菌,導(dǎo)致人獸共患病——李斯特菌病(Listeriosis)。Lm適應(yīng)性較強(qiáng),在自然界環(huán)境中是腐生菌,但侵入動(dòng)物機(jī)體后就搖身變成了致病菌。由感應(yīng)外界信號(hào)的組氨酸激酶(Histidine kinase,HK)和調(diào)控胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)的應(yīng)答調(diào)控子(Response regulator,RR)組成的細(xì)菌雙組分信號(hào)系統(tǒng)(Two-Component Signal Transduction System,TCS)是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的重要調(diào)控系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn),Lm侵入機(jī)體變成致病菌,這種角色的轉(zhuǎn)變與Lm的TCS中的有些RR密切相關(guān),但與負(fù)責(zé)感應(yīng)外界信號(hào)的HK的相關(guān)性的報(bào)道則鮮見。因此,本研究以Lm的HKs為研究對(duì)象,探究HKs與Lm的毒力的相關(guān)性,從而為進(jìn)一步了解Lm的致病性及預(yù)防和治療李斯特菌病提供理論依據(jù)。本課題組對(duì)Lm食品分離株LM201進(jìn)行了全基因組測(cè)序和分析,搜索、分析和總結(jié)了LM201中的TCSs,得知LM201共有14對(duì)HK/RR和兩個(gè)孤兒RR。本研究以LM201為材料,分別成功構(gòu)建了13株HK的缺失菌株,對(duì)缺失株進(jìn)行了生長(zhǎng)曲線測(cè)定、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和小鼠毒力測(cè)定,具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.HK缺失株的構(gòu)建以溫敏自殺性質(zhì)粒pHT304-ts為載體,用同源重組的方法成功構(gòu)建了13株LM201的HK缺失株,分別是S0106(?cheA)、S0132(?cesK)、S0142(?phoR)、S0152(?hssS)、S0162(?kdpD)、S0172(?agrC)、S0182(?liaS)、S0192(?lisK)、S01A2(?yclK)、S01B2(?resE)、S01C2(?eutW)S01D2(?virS)和S01E2(?yesM)。2.缺失株生長(zhǎng)曲線測(cè)定對(duì)13株缺失株進(jìn)行37℃生長(zhǎng)曲線測(cè)定,結(jié)果顯示,菌株S0106(?cheA)、S0142(?phoR)、S0162(?kdpD)和S0172(?agrC)在穩(wěn)定期時(shí)細(xì)菌量低于親本株LM201,其他缺失株與LM201生長(zhǎng)趨勢(shì)一致。對(duì)13株缺失株進(jìn)行5℃生長(zhǎng)曲線測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與親本株LM201相比菌株S0192(?lisK)的生長(zhǎng)速度變緩慢,其他缺失株與LM201生長(zhǎng)趨勢(shì)一致。3.缺失株細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果13株缺失株上皮細(xì)胞Caco-2(結(jié)腸腺癌細(xì)胞)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與親本株LM201相比,S0192(?lisK)、S01D2(?virS)和S01E2(?yesM)的黏附與侵襲能力均顯著下降,S0106(?cheA)和S01A2(?yclK)的黏附能力顯著上升,S01B2(?resE)和S01C2(?eutW)的侵襲能力顯著上升。HBMEC(人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,S0182(?liaS)的黏附與侵襲能力與親本株LM201相比均顯著上升,S0132(?cesK)和S01B2(?resE)黏附能力顯著下降,S0172(?agrC)的侵襲能力顯著上升。RAW264.7細(xì)胞(小鼠巨噬細(xì)胞)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與親本株LM201相比,缺失株S01D2(?virS)、S01B2(?resE)和S01C2(?eutW)在細(xì)胞中的細(xì)菌量顯著下降,說明基因virS、resE或eutW缺失會(huì)導(dǎo)致Lm在RAW264.7細(xì)胞中的存活能力減弱。4.缺失株的小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)13株缺失株進(jìn)行了小鼠組織載菌量實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,S0172(?agrC)在24h肝臟載菌量顯著下降,48h肝臟和脾臟載菌量顯著上升,72h肝臟和脾臟載菌量又顯著下降。S0192(?lisK)在24h和48h的肝臟和脾臟載菌量均顯著下降。S01E2(?yesM)在48h肝臟和脾臟載菌量顯著下降,在72h脾臟載菌量顯著下降。13株缺失株半數(shù)致死量(LD_(50))測(cè)定結(jié)果顯示,菌株S0152(?hssS)、S0172(?agrC)和S01D2(?virS)與親本株LM201(LD_(50)為2.08×10~5)相比LD_(50)上升較高,分別為9.84×10~5、10.37×10~5和9.78×10~5,其毒力與LM201相比分別下降4.73、4.99和4.70倍。菌株S0142(?phoR)、S0162(?kdpD)和S0182(?liaS)的LD_(50)分別為8.4×10~4、1.18×10~5和1.24×10~5,與LM201(LD_(50)為2.08×10~5)相比毒力上升。綜合以上結(jié)果,發(fā)現(xiàn)13個(gè)HK中HssS、AgrC、LisK、VirS或YesM缺失導(dǎo)致Lm的毒力下降,LiaS缺失導(dǎo)致Lm毒力上升。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

單增李斯特菌雙組分信號(hào)系統(tǒng)的組氨酸激酶與毒力相關(guān)性研究現(xiàn)出輕微的類似流感的癥狀。而對(duì)于抵抗力低下的易感機(jī)都比較相似，如出現(xiàn)呼吸急促、昏迷、胃腸炎、化膿性結(jié)狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡（Sleator and Hill 2006）。研究表明炎，腦干腦炎，腦膜腦炎等是造成死亡的主要原因（D

單增李斯特菌雙組分信號(hào)系統(tǒng)的組氨酸激酶與毒力相關(guān)性研ATP 結(jié)合以便 HK 獲得磷酸集團(tuán)自身磷酸化（Bhate et a內(nèi)，其位于 N 端的信號(hào)接收結(jié)構(gòu)域（receiver domain,來接收來自 HK 的磷酸集團(tuán)；C 端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（effectorA、RNA 或蛋白質(zhì)結(jié)合，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞行為以便做出正

單增李斯特菌雙組分信號(hào)系統(tǒng)的組氨酸激酶與毒力相關(guān)性研究 缺失突變株的構(gòu)建源臂的 PCR 擴(kuò)增及上下游同源臂 Over-lap 連接LM201 為模板擴(kuò)增目標(biāo)基因的上下游同源臂，用 0.8%~1%的瓊脂糖的條帶，將擴(kuò)增得到的正確的上、下游同源臂片段回收，用 Over-標(biāo)基因的上下游同源臂融合起來，融合產(chǎn)物用 0.8%~1%瓊脂糖凝膠大小與上下游同源臂融合后的片段一致，如圖 4-1。
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本文編號(hào)：2892175