發(fā)布時間：2020-11-20 23:35

　　 單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenges,Lm)簡稱單增李斯特菌,屬革蘭氏陽性菌,是WHO劃定的重要食源性病原菌,導致人獸共患病——李斯特菌病(Listeriosis)。Lm適應性較強,在自然界環(huán)境中是腐生菌,但侵入動物機體后就搖身變成了致病菌。由感應外界信號的組氨酸激酶(Histidine kinase,HK)和調控胞內相關基因表達的應答調控子(Response regulator,RR)組成的細菌雙組分信號系統(tǒng)(Two-Component Signal Transduction System,TCS)是細菌適應環(huán)境的重要調控系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn),Lm侵入機體變成致病菌,這種角色的轉變與Lm的TCS中的有些RR密切相關,但與負責感應外界信號的HK的相關性的報道則鮮見。因此,本研究以Lm的HKs為研究對象,探究HKs與Lm的毒力的相關性,從而為進一步了解Lm的致病性及預防和治療李斯特菌病提供理論依據。本課題組對Lm食品分離株LM201進行了全基因組測序和分析,搜索、分析和總結了LM201中的TCSs,得知LM201共有14對HK/RR和兩個孤兒RR。本研究以LM201為材料,分別成功構建了13株HK的缺失菌株,對缺失株進行了生長曲線測定、細胞實驗和小鼠毒力測定,具體實驗結果如下:1.HK缺失株的構建以溫敏自殺性質粒pHT304-ts為載體,用同源重組的方法成功構建了13株LM201的HK缺失株,分別是S0106(?cheA)、S0132(?cesK)、S0142(?phoR)、S0152(?hssS)、S0162(?kdpD)、S0172(?agrC)、S0182(?liaS)、S0192(?lisK)、S01A2(?yclK)、S01B2(?resE)、S01C2(?eutW)S01D2(?virS)和S01E2(?yesM)。2.缺失株生長曲線測定對13株缺失株進行37℃生長曲線測定,結果顯示,菌株S0106(?cheA)、S0142(?phoR)、S0162(?kdpD)和S0172(?agrC)在穩(wěn)定期時細菌量低于親本株LM201,其他缺失株與LM201生長趨勢一致。對13株缺失株進行5℃生長曲線測定,結果發(fā)現(xiàn),與親本株LM201相比菌株S0192(?lisK)的生長速度變緩慢,其他缺失株與LM201生長趨勢一致。3.缺失株細胞實驗結果13株缺失株上皮細胞Caco-2(結腸腺癌細胞)細胞實驗結果表明,與親本株LM201相比,S0192(?lisK)、S01D2(?virS)和S01E2(?yesM)的黏附與侵襲能力均顯著下降,S0106(?cheA)和S01A2(?yclK)的黏附能力顯著上升,S01B2(?resE)和S01C2(?eutW)的侵襲能力顯著上升。HBMEC(人腦微血管內皮細胞)細胞實驗結果顯示,S0182(?liaS)的黏附與侵襲能力與親本株LM201相比均顯著上升,S0132(?cesK)和S01B2(?resE)黏附能力顯著下降,S0172(?agrC)的侵襲能力顯著上升。RAW264.7細胞(小鼠巨噬細胞)實驗結果顯示,與親本株LM201相比,缺失株S01D2(?virS)、S01B2(?resE)和S01C2(?eutW)在細胞中的細菌量顯著下降,說明基因virS、resE或eutW缺失會導致Lm在RAW264.7細胞中的存活能力減弱。4.缺失株的小鼠實驗結果對13株缺失株進行了小鼠組織載菌量實驗,結果顯示,S0172(?agrC)在24h肝臟載菌量顯著下降,48h肝臟和脾臟載菌量顯著上升,72h肝臟和脾臟載菌量又顯著下降。S0192(?lisK)在24h和48h的肝臟和脾臟載菌量均顯著下降。S01E2(?yesM)在48h肝臟和脾臟載菌量顯著下降,在72h脾臟載菌量顯著下降。13株缺失株半數致死量(LD_(50))測定結果顯示,菌株S0152(?hssS)、S0172(?agrC)和S01D2(?virS)與親本株LM201(LD_(50)為2.08×10~5)相比LD_(50)上升較高,分別為9.84×10~5、10.37×10~5和9.78×10~5,其毒力與LM201相比分別下降4.73、4.99和4.70倍。菌株S0142(?phoR)、S0162(?kdpD)和S0182(?liaS)的LD_(50)分別為8.4×10~4、1.18×10~5和1.24×10~5,與LM201(LD_(50)為2.08×10~5)相比毒力上升。綜合以上結果,發(fā)現(xiàn)13個HK中HssS、AgrC、LisK、VirS或YesM缺失導致Lm的毒力下降,LiaS缺失導致Lm毒力上升。
【學位單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

單增李斯特菌雙組分信號系統(tǒng)的組氨酸激酶與毒力相關性研究現(xiàn)出輕微的類似流感的癥狀。而對于抵抗力低下的易感機都比較相似，如出現(xiàn)呼吸急促、昏迷、胃腸炎、化膿性結狀，嚴重者可導致死亡（Sleator and Hill 2006）。研究表明炎，腦干腦炎，腦膜腦炎等是造成死亡的主要原因（D

單增李斯特菌雙組分信號系統(tǒng)的組氨酸激酶與毒力相關性研ATP 結合以便 HK 獲得磷酸集團自身磷酸化（Bhate et a內，其位于 N 端的信號接收結構域（receiver domain,來接收來自 HK 的磷酸集團；C 端效應結構域（effectorA、RNA 或蛋白質結合，從而調節(jié)細胞行為以便做出正

單增李斯特菌雙組分信號系統(tǒng)的組氨酸激酶與毒力相關性研究 缺失突變株的構建源臂的 PCR 擴增及上下游同源臂 Over-lap 連接LM201 為模板擴增目標基因的上下游同源臂，用 0.8%~1%的瓊脂糖的條帶，將擴增得到的正確的上、下游同源臂片段回收，用 Over-標基因的上下游同源臂融合起來，融合產物用 0.8%~1%瓊脂糖凝膠大小與上下游同源臂融合后的片段一致，如圖 4-1。
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本文編號：2892175