發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 16:29

　　 血清4型禽腺病毒(FAdV-4)屬于禽腺病毒屬。近年來(lái),國(guó)內(nèi)雞群由FAdV-4引起的包涵體肝炎、心包積液病例逐漸增多。FAdV-4不僅感染3-7周齡肉雞,還感染10-20周齡的蛋雞,給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于滅活疫苗的研制及應(yīng)用,今后如何來(lái)鑒別雞群是自然感染還是處于免疫狀態(tài),對(duì)FAdV-4有效及時(shí)防控至關(guān)重要。本研究以FAdV-4的非結(jié)構(gòu)蛋白中的22K和52K為靶點(diǎn),通過(guò)多肽合成,建立分別檢測(cè)22K和52K蛋白抗體的基于多肽表位的ELISA方法,并評(píng)價(jià)其能否用于區(qū)分檢測(cè)自然感染雞群與滅活疫苗免疫雞群。1.檢測(cè)FAdV-4非結(jié)構(gòu)蛋白22K、52K抗體的ELISA方法建立為區(qū)分檢測(cè)自然感染雞群與滅活疫苗免疫雞群,本研究在利用DNA Star對(duì)FAdV-4非結(jié)構(gòu)蛋白22K及52K進(jìn)行抗原性分析的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了多肽合成、篩選,并建立了檢測(cè)22K及52K蛋白抗體的ELISA方法。多肽篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn),22K-4P和52K-4P合成多肽與FAdV-4陽(yáng)性血清反應(yīng)性最佳。通過(guò)條件優(yōu)化,分別建立了基于22K-4P和52K-4P多肽的檢測(cè) FAdV-4 抗體的 ELISA 方法,22K-4P-ELISA 以及 52K-4P-ELISA。22K-4P-ELISA 以及52K-4P-ELISA的CUT-OFF值分別為0.1668以及0.182。特異性試驗(yàn)證明所建立的兩個(gè)ELISA僅與FAdV-4多抗血清反應(yīng),而不與所檢測(cè)的抗其它禽類病毒包括雞貧血病毒(CAV)、血清8型禽腺病毒(FAdV-8)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、馬立克氏病病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)的多抗血清反應(yīng)。重復(fù)性試驗(yàn)表明所建立的兩個(gè)ELISA的批內(nèi)及批間的變異系數(shù)均小于10%。檢測(cè)FAdV-4抗體的22K-4P-ELISA以及52K-4P-ELISA方法的建立,為區(qū)分檢測(cè)自然感染雞群與滅活疫苗免疫雞群提供了技術(shù)可能。2.檢測(cè)FAdV-4非結(jié)構(gòu)蛋白22K、52K抗體的ELISA方法的初步應(yīng)用為評(píng)價(jià)所建立的22K-4P-ELISA以及52K-4P-ELISA方法能否用于區(qū)分檢測(cè)自然感染雞群與滅活疫苗免疫雞群,將22K-4P-ELISA以及52K-4P-ELISA對(duì)FAdV-4人工感染雞群,臨床發(fā)病雞群以及滅活疫苗免疫雞群血清進(jìn)行了檢測(cè):并與基于結(jié)構(gòu)蛋白Fiber2的檢測(cè)FAdV-4抗體的ELISA以及IFA方法進(jìn)行了比較。檢測(cè)結(jié)果表明:在檢測(cè)24份FAdV-4人工感染雞群雞血清樣品時(shí),22K-4P-ELISA,52K-4P-ELISA,F2-ELISA和IFA的陽(yáng)性率分別為87.5%、95.8%、100%和100%;在檢測(cè)189份臨床發(fā)病雞群雞血清樣品時(shí),22K-4P-ELISA,52K-4P-ELISA,F2-ELISA 和 IFA 的陽(yáng)性率分別為 85.7%、88.9%、96.3%和93.7%;在檢測(cè)81滅活疫苗免疫雞群血清中,22K-4P-ELISA,52K-4P-ELISA,F2-ELISA和IFA的陽(yáng)性率分別為2.5%,0%,100%和100%。以上結(jié)果表明,本研究建立的22K-4P-ELISA和52K-4P-ELISA方法可以鑒別雞群是FAdV-4自然感染還是處于FAdV-4滅活疫苗免疫狀態(tài),可為FAdV-4的防控與凈化提供技術(shù)支撐。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

圖１－２?５２Ｋ抗原性分析??

冬令?冬多?冬冬??５２Ｋ多肽編號(hào)??圖１－４?５２Ｋ非結(jié)構(gòu)蛋白分段后的多肽與血清的反應(yīng)??Ｆｉｇｕｒｅ?１－４?Ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ｐｅｐｔｉｄｅｓ?ｄｅｒｉｖｅｄ?ｆｒｏｍ?５２Ｋ?ａｎｄ?ｓｅｒｕｍ??３．３間接ＥＬＩＳＡ方法的建立及優(yōu)化??３．３．１最佳封閉及稀釋液的選擇??封閉液及待檢血清稀釋液分別為２％?ＢＳＡ／２％?ＢＳＡ、８％?ＲＳ／８％?ＲＳ、５％脫脂乳＋１％小??牛血清／Ｉ％脫脂乳稀釋和５％脫脂乳＋１％小牛血清／ＰＢＳＴ稀釋時(shí)，２２Ｋ－４Ｐ多肽最佳封閉及稀??釋液的選擇結(jié)果見(jiàn)表１－３，圖１－５；?５２Ｋ－４Ｐ多肽最佳封閉及稀釋液的選擇結(jié)果見(jiàn)表１－４，圖??１－６。從表格以及圖中數(shù)據(jù)可見(jiàn)，２２Ｋ－４Ｐ多肽和５２Ｋ－４Ｐ多肽用２％ＢＳＡ作為封閉、稀釋液??時(shí)非特異性較低

?ｉｎｉ??＿?ｚ?／?／?／??／?／?ｖ??血清來(lái)源??圖１－６?５２Ｋ－４Ｐ多肽最偵封閉及稀釋液的選擇??Ｆｉｇｕｒｅ?１－６?Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｏｐｔｉｍａｌ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ｂｌｏｃｋｉｎｇ?ａｎｄ?ｄｉｌｕｔｉｏｎ?ｆｏｒ?５２Ｋ－４Ｐ??３．３．２最佳封閉時(shí)間的確定??按照５卜ｉｇ／ｍｌ的抗原濃度進(jìn)行包被酶標(biāo)板，用２％?ＢＳＡ封閉液進(jìn)行封閉，封閉時(shí)間設(shè)立??以下幾個(gè)時(shí)間（３０ｍｉｎ、ｌｈ、２ｈ、３ｈ）。按間接ＥＵＳＡ程序進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定其〇Ｄ４５０ｎｍ值，??并計(jì)算ＯＤ４５０ｎｍ的平均值，結(jié)果顯示封閉時(shí)間ｌｈ時(shí)，Ｐ／Ｎ值最大，封閉效果最好。因此，??最佳封閉時(shí)間為］ｈ。具體結(jié)果見(jiàn)表１－５，圖１－７。??
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本文編號(hào)：2887702