發(fā)布時(shí)間：2020-11-15 08:24

　　 豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由冠狀病毒科,α冠狀病毒屬成員的豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以嚴(yán)重腹瀉,伴有嘔吐,脫水,食欲下降等特征的一種高度接觸性烈性腸道傳染病,主要危害仔豬,對(duì)于仔豬有極高的致病率以及致死率,嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。自1971年首次在英國(guó)發(fā)現(xiàn)以來(lái),該病已經(jīng)陸續(xù)蔓延并傳播至全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū),給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前對(duì)于該病預(yù)防控制主要依靠疫苗免疫,在治療方法上卻尚未有重大突破。而關(guān)于PEDV的致病機(jī)制尤其是在凋亡信號(hào)通路領(lǐng)域的研究還不完全清楚,需要進(jìn)一步研究。因此,研究PEDV致Vero凋亡的分子機(jī)制對(duì)尋找新的抗病毒途徑來(lái)說(shuō)非常重要。本研究對(duì)PEDV感染Vero細(xì)胞的凋亡信號(hào)進(jìn)行篩選并對(duì)凋亡信號(hào)與凋亡之間相關(guān)性進(jìn)行研究,獲得以下結(jié)果:1.用間接免疫熒光試驗(yàn),Western blot以及流式細(xì)胞術(shù)篩選不同分子信號(hào)在PEDV感染Vero細(xì)胞中的變化情況。首先,用PEDV感染Vero觀察細(xì)胞的病變效應(yīng),用間接免疫熒光試驗(yàn)觀察PEDV的增殖,在證實(shí)PEDV感染能夠?qū)е录?xì)胞病變的基礎(chǔ)上,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同感染復(fù)數(shù)(MOI分別為0.1、0.5、1)的PEDV感染細(xì)胞24 h的細(xì)胞凋亡發(fā)生率,檢測(cè)了p53家族、ROS含量以及MAPK家族蛋白在不同感染時(shí)間下的含量變化。結(jié)果顯示,隨著感染復(fù)數(shù)的遞增,PEDV誘導(dǎo)Vero細(xì)胞的凋亡發(fā)生率也呈遞增趨勢(shì)。p53的Western blot試驗(yàn)表明PEDV能夠顯著活化p-p53(Ser20),顯著增加CBP(cAMP-responsive element-binding protein)和MDM2(Murine double minute2 protein)的表達(dá),對(duì)p53的間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明,在病毒感染期間,p53移位至細(xì)胞核發(fā)揮作用。MAPK家族的Western blot結(jié)果表明,PEDV感染能夠顯著活化p38 MAPK和SAPK/JNK,使p-p38 MAPK以及p-SAPK/JNK蛋白表達(dá)量增加。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同PEDV感染時(shí)間的ROS含量檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明,PEDV能夠顯著引發(fā)ROS的累積,且這種累積效應(yīng)隨感染時(shí)間延長(zhǎng)而越加明顯。2.用Western blot以及流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)活化的ROS,MAPK以及p53家族與PEDV誘導(dǎo)Vero細(xì)胞凋亡之間的聯(lián)系,采用抑制試驗(yàn)對(duì)本部分的結(jié)果加以驗(yàn)證。首先,用p53特異性抑制劑Pifithrin-α(PFT-α)預(yù)處理Vero細(xì)胞1 h后感染PEDV 24 h,后采用流式細(xì)胞術(shù)、Western blot檢測(cè)凋亡率以及Bax、Bcl-2、FasL等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá);其次,用p38 MAPK、JNK抑制劑SB203580以及SP600125預(yù)處理Vero細(xì)胞1 h后感染PEDV 24 h,檢測(cè)Bax、Bcl-2、FasL等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá);最后,用抗氧化劑NAC以及PDTC處理Vero細(xì)胞1 h后感染PEDV 24 h,流式細(xì)胞術(shù)、Western blot檢測(cè)凋亡發(fā)生率以及Fas,FasL,Bax和Bcl-2等凋亡蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明,PEDV感染顯著增加Bax的相對(duì)表達(dá)量,減少Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量,且PFT-α作用下能夠顯著逆轉(zhuǎn)由PEDV引起的Bax增多以及Bcl-2的降低,并上調(diào)Bax/Bcl-2比率,逆轉(zhuǎn)PEDV引起的凋亡發(fā)生率,表明抑制p53能夠顯著逆轉(zhuǎn)PEDV誘導(dǎo)的Vero細(xì)胞凋亡;與PEDV感染組相比,無(wú)論是SB203580還是SP600125處理組均無(wú)法改變Bcl-2、Bax和FasL的表達(dá)量,表明在抑制p38 MAPK和SAPK/JNK的情況下,無(wú)法逆轉(zhuǎn)由PEDV引起的Vero細(xì)胞凋亡,即p38 MAPK和SAPK/JNK的活化與PEDV誘導(dǎo)的Vero細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān);與PEDV感染組相比,NAC、PDTC處理組的凋亡發(fā)生率也顯著降低,FasL/Fas的比例在PEDV感染組或是抗氧化劑處理中沒(méi)有顯著變化,而B(niǎo)ax/Bcl-2的比率顯著降低,表明PDTC和NAC處理明顯逆轉(zhuǎn)了PEDV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的抑制試驗(yàn)表明,p53部分由ROS介導(dǎo),即ROS為p53上游。綜上所述,PEDV感染引起Vero產(chǎn)生細(xì)胞病變并以劑量依賴的方式誘導(dǎo)Vero細(xì)胞發(fā)生凋亡,且PEDV感染能夠誘導(dǎo)p53,p38 MAPK和SAPK/JNK的活化以及ROS的累積,活化的p53以及ROS參與PEDV誘導(dǎo)的Vero細(xì)胞凋亡,而p38 MAPK和SAPK/JNK的活化與PEDV誘導(dǎo)的Vero細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.651
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號(hào)對(duì)照表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 豬流行性腹瀉病毒研究概述
        1.1.1 PEDV的分類以及理化性質(zhì)
        1.1.2 PEDV的基因組結(jié)構(gòu)及編碼蛋白
        1.1.3 PEDV的感染與致病機(jī)理
    1.2 細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展
        1.2.1 細(xì)胞凋亡概述
        1.2.2 細(xì)胞凋亡的過(guò)程
        1.2.3 細(xì)胞凋亡的生理意義
        1.2.4 細(xì)胞凋亡涉及的信號(hào)通路
        1.2.5 病毒感染與細(xì)胞凋亡
    1.3 本研究的目的與意義
第二章 PEDV誘導(dǎo)Vero細(xì)胞凋亡的分子信號(hào)篩選
    2.1 材料
        2.1.1 細(xì)胞、病毒與抗體
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 相關(guān)試劑的配制
    2.2 方法
        2.2.1 Vero細(xì)胞培養(yǎng),復(fù)蘇,傳代及凍存
        2.2.2 PEDV的增殖
50 測(cè)定'>        2.2.3 PEDV TCID₅₀ 測(cè)定
        2.2.4 PEDV的接毒以及樣品制備
        2.2.5 PEDV感染Vero細(xì)胞的病變觀察
        2.2.6 間接免疫熒光觀察p53 的變化以及PEDV感染
        2.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        2.2.8 ROS的檢測(cè)
        2.2.9 Western blot檢測(cè)
        2.2.10 數(shù)據(jù)分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 PEDV感染Vero細(xì)胞病變觀察
        2.3.2 IFA確定PEDV感染情況
        2.3.3 PEDV感染對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
        2.3.4 PEDV感染對(duì)p53 的影響
        2.3.5 PEDV感染對(duì)MAPK家族的影響
        2.3.6 PEDV感染對(duì)ROS的影響
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 活化的凋亡信號(hào)與PEDV誘導(dǎo)凋亡的相關(guān)性研究
    3.1 材料
        3.1.1 細(xì)胞、病毒與抗體
        3.1.2 試劑
        3.1.3 主要儀器設(shè)備
        3.1.4 相關(guān)試劑的配制
    3.2 方法
        3.2.1 抑制試驗(yàn)
        3.2.2 Western blot檢測(cè)抑制劑/抗氧化劑作用下的凋亡蛋白變化
        3.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)抑制劑/抗氧化劑作用下的細(xì)胞凋亡
        3.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)抑制劑/抗氧化劑作用下的ROS生成量
        3.2.5 MTT法檢測(cè)抑制劑/抗氧化劑的細(xì)胞毒性
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 抑制p53 對(duì)細(xì)胞凋亡以及凋亡蛋白的影響
        3.3.2 抑制p38 MAPK,SAPK/JNK對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響
        3.3.3 使用抗氧化劑處理對(duì)凋亡以及凋亡蛋白的影響
        3.3.4 分別使用抗氧化劑、p53 抑制劑處理對(duì)p53 以及ROS含量的影響
        3.3.5 MTT試驗(yàn)檢測(cè)各分子抑制劑對(duì)細(xì)胞活性的抑制作用
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷

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