發(fā)布時間：2020-11-14 17:33

　　 日本乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)的NS1蛋白是其重要的非結(jié)構(gòu)蛋白,在病毒的增殖、復(fù)制、裝配、免疫逃避等方面發(fā)揮重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)宿主蛋白DAZAP2是NS1蛋白的互作蛋白之一,本研究旨在探究宿主蛋白DAZAP2對乙腦病毒的增殖復(fù)制是否有影響,進一步揭示宿主蛋白DAZAP2在乙腦病毒增殖與復(fù)制中發(fā)揮的作用。首先,構(gòu)建DAZAP2基因的靶向干擾質(zhì)粒和DAZAP2基因敲除細胞系及檢測用標準曲線。研究中成功構(gòu)建針對DAZAP2基因的靶向干擾質(zhì)粒,最高干擾效率達53.7%;運用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建DAZAP2基因敲除細胞系;成功構(gòu)建了用于檢測干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染水平、DAZAP2基因表達情況、評價JEV mRNA水平的NS1基因、E基因及細胞內(nèi)參β-actin的熒光定量標準曲線,R~2均大于0.99;其次,對DAZAP2蛋白的表達抑制干擾發(fā)現(xiàn)其正向調(diào)節(jié)了JEV的mRNA和子代病毒粒子水平。干擾293細胞上宿主蛋白DAZAP2的表達后,相對熒光定量和WB檢測顯示JEV增殖復(fù)制無明顯變化,推斷可能由于shRNA的靶向位點的沉默效率不夠;在DAZAP2基因敲除細胞系上,接種JEV,運用相對熒光定量、WB及蝕斑分析,發(fā)現(xiàn)JEV mRNA水平較對照組提高約1.6倍,子代病毒滴度為6.35 pfu/ml,為對照組的1.27倍,但在該細胞系上轉(zhuǎn)染乙腦病毒復(fù)制子,運用相對熒光定量和WB檢測,未見明顯變化。最后,DAZAP2蛋白過表達發(fā)現(xiàn)其影響了JEV mRNA水平。通過相對熒光定量和WB分析,證實過表達宿主蛋白DAZAP2后,感染JEV,其JEV mRNA相較對照組提升約3倍,mRNA水平顯著提高。綜上結(jié)果證實了293細胞的蛋白DAZAP2是一種對JEV的增殖與復(fù)制有影響的重要宿主蛋白。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

圖 1-1 乙腦病毒的主要分布及基因型[10]Fig.1-1 Genotype spread of JEV[10]病毒顆粒為球形，基因是單股正鏈 RNA，病毒基因全長約 11kb（圖 1-2毒的 3 種結(jié)構(gòu)蛋白（分別為：C、PrM 和 E）和 7 種非結(jié)構(gòu)蛋白（分別為：S2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5）[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)乙腦病毒 C 蛋白S3 蛋白和 NS5 蛋白與病毒的增殖復(fù)制相關(guān)。Tsuda[11]等和 Katoh[12]等研 蛋白能夠進入細胞核后參與病毒基因組的復(fù)制。Liu 等[13]通過 RNA 干 蛋白的表達能夠達到抑制乙腦病毒復(fù)制的效果。Chen 等[14]研究證實 JE白與病毒的復(fù)制有密切關(guān)聯(lián)。隨后又有學(xué)者陸續(xù)報道 NS3 和 NS5 對 JE響，如 Yuan 等[15]通過 RNA 干擾技術(shù)證明了 JEV NS3 蛋白對 JEV 的增。，近年的研究表明，JEV 蛋白與宿主細胞蛋白的相互作用對病毒入侵、

圖 1-2 乙腦病毒的結(jié)構(gòu)[10]Fig.1-2 JEV structure[10]蛋白對黃病毒增殖與復(fù)制的影響作為一類結(jié)構(gòu)較簡單的 RNA 病毒，大量研究證實病毒的復(fù)制不僅需形成的復(fù)制復(fù)合體的作用，更需要大量宿主蛋白的參與。這些宿主蛋制、病毒蛋白翻譯修飾、復(fù)制復(fù)合體形成等方面發(fā)揮重要功能。蛋白與 JEV 病毒蛋白相互作用對病毒增殖與復(fù)制的影響衣殼蛋白（Capsid protein），能夠進入細胞核后參與病毒基因組的復(fù)制， 通過 JEV C 蛋白的 Glv42 和 Pr043 位點與宿主細胞核仁上的蛋白進病毒 RNA 復(fù)制和病毒蛋白表達。Katoh[12]等通過質(zhì)譜分析和 PullnRNPA2 能與 C 蛋白及病毒基因組相互作用，正向調(diào)控病毒的復(fù)制

過設(shè)計乙腦病毒 NS1 蛋白的多種干擾質(zhì)粒，研究 NS1 蛋白受干擾后，乙腦的病毒復(fù)制被抑制。Lei Yuan[48]等通過設(shè)計 的靶向沉默位點，構(gòu)建 shRNA，沉默 NS3 和 NS4A 蛋白的被抑制。Qingqiang Xu[49]等通過運用 siRNA 沉默宿主蛋白 N4 能夠促進 JEV 病毒的復(fù)制。用 RNAi 特異性地抑制宿主基現(xiàn)研究基因基因的重要功能，已經(jīng)取得顯著成果[37, 38]，RN能的工具。輯技術(shù)的研究及應(yīng)用是基于目標基因的 DNA 雙鏈斷裂[50]，對細胞基因組中目的、剪切、增加或者插入外源基因序列[51-53]。自 1979 年在酵0 年的時間，在學(xué)者的不懈努力和研究下，基因編輯技術(shù)已（圖 1-3）[54]。
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本文編號：2883754