發(fā)布時(shí)間：2020-11-12 13:27

　　 羊傳染性膿皰病毒(Contagious Ecthyma virus of sheep)亦稱羊口瘡病毒(Orf virus,ORFV)能引起山羊和綿羊急性、接觸性皮膚傳染性疾病,患病羊主要表現(xiàn)在唇部、口腔黏膜形成紅斑、丘疹、膿皰、潰瘍和結(jié)成疣狀厚痂。感染ORFV后機(jī)體能產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng),并且ORFV可以編碼大量的免疫調(diào)節(jié)蛋白用于宿主免疫或炎癥反應(yīng)通路實(shí)現(xiàn)對宿主的免疫調(diào)節(jié)作用。趨化因子結(jié)合蛋白(Chemokine binding protein,CBP)是ORFV在感染早期表達(dá)的一種重要的毒力蛋白,在調(diào)控宿主免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要的作用。DC作為體內(nèi)唯一一個(gè)能夠直接刺激初始T細(xì)胞活化增殖的抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell,APC),在免疫調(diào)節(jié)和介導(dǎo)外周性免疫耐受中發(fā)揮重要的免疫應(yīng)答作用。目前關(guān)于體外條件下ORFV及其毒力蛋白CBP作用于小鼠骨髓源DC的研究甚少。因此,本實(shí)驗(yàn)通過表達(dá)純化原核蛋白CBP;通過表面標(biāo)志物、細(xì)胞因子等試驗(yàn)檢測ORFV及蛋白CBP是否促進(jìn)DCs細(xì)胞的分化和成熟;最后對ORFV及CBP作用前、后引起DCs的差異基因進(jìn)行分析驗(yàn)證。本試驗(yàn)為研究ORFV與宿主免疫細(xì)胞的相互作用提供理論依據(jù),為進(jìn)一步闡釋ORFV感染宿主的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。取得的結(jié)論如下:1、構(gòu)建了pET-28a(+)-ORFV112原核表達(dá)載體,成功表達(dá)純化了該蛋白;2、成功制備了純度較高的DCs,不同濃度的羊口瘡病毒均能夠極顯著的促進(jìn)DCs表面共刺激分子CD86、CD40的表達(dá),顯著增加IL-1β、IL-6、IL-12以及TNF-α等細(xì)胞因子的分泌量;100ng CBP蛋白作用DCs后共刺激分子和細(xì)胞因子均顯著增加,與病毒作用DC后所產(chǎn)生的效果相類似。另外羊口瘡病毒及100ng CBP蛋白均能夠促進(jìn)小鼠DC的成熟并誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1方向分化,以及促進(jìn)T細(xì)胞釋放IFN-γ細(xì)胞因子來增加機(jī)體對外來病原體的殺傷作用。3、采用RNA-seq測序技術(shù)對ORFV和CBP蛋白作用后的DC的基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測,結(jié)果表明ORFV刺激DCs組與未刺激組相比,共有8241個(gè)差異基因,上調(diào)基因4205個(gè),下調(diào)基因4036個(gè);CBP刺激DC后與未刺激的細(xì)胞相比,共有7301個(gè)差異基因,上調(diào)基因3535個(gè),下調(diào)基因3766個(gè)。差異基因分析結(jié)果顯示,共同變化的差異基因主要集中于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號通路、抗原遞呈與加工過程、T細(xì)胞受體信號通路以及細(xì)胞周期和凋亡等途徑中。4、RT-PCR結(jié)果顯示共同差異基因CD8B、Ctse、IL2RA、Atp5e、CD80、Lck、CCL8與DC組相比,均為顯著上調(diào),基因Cstb、Akt、CCR1與DC組相比,均為顯著下調(diào),與RNA-seq測序結(jié)果一致。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

12物（見圖 2.2）；用限制性的片段。圖 2.1 ORFV-112 基因擴(kuò)增結(jié)果.2.1 Amplification of ORFV-112NA Marker DL 2000；1：PCRA Marker DL 2000；1：Amplification

13聲處理后，離心收集上清及沉淀，表明 pET-28a-CBP 蛋白在上清和沉.4 重組蛋白 pET-28a-CBP 的 SDS-PAGE 分S-PAGE analysis of recombinant protein pET誘導(dǎo) pET-28a-CBP 表達(dá)菌；2-4：經(jīng) IPTGarker；1：Non-induced recombinant bacteriT-28a-CBP under inducing conditions by IPT

組質(zhì)粒的小劑量誘導(dǎo)誘導(dǎo)、誘導(dǎo)樣品 pET-28a-CBP 表達(dá)菌進(jìn)行 SDS-PAGE 可知，pET-28a-CBP 經(jīng)誘目的蛋白表達(dá)，且其大小與預(yù)期相符（見圖 2.4）圖 2.3 pET-28a-CBP 質(zhì)粒的雙酶切鑒Fig.2.3 Identification of pET-28a-CBP digested wXho ⅠM:DNA Marker DL 5000；1：pET-28a-CBP 質(zhì)2：空載體雙酶切產(chǎn)物M:DNA Marker DL 5000; 1: double digestiopET-28a-CBP plasmid; 2: double digestion provector圖 2.2 pET-28a-CBP 質(zhì)粒的 PCR 鑒定.2.2 Identification of pET-28a-CBP by PRCA Marker DL 2000；1-2：PCR 產(chǎn)物；3：陰性對照A Marker DL 2000；1-2：Amplification ofPCR；3：Negative control
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本文編號：2880794