發(fā)布時間：2020-11-12 13:27

　　 羊傳染性膿皰病毒(Contagious Ecthyma virus of sheep)亦稱羊口瘡病毒(Orf virus,ORFV)能引起山羊和綿羊急性、接觸性皮膚傳染性疾病,患病羊主要表現(xiàn)在唇部、口腔黏膜形成紅斑、丘疹、膿皰、潰瘍和結(jié)成疣狀厚痂。感染ORFV后機體能產(chǎn)生強烈的免疫應答反應,并且ORFV可以編碼大量的免疫調(diào)節(jié)蛋白用于宿主免疫或炎癥反應通路實現(xiàn)對宿主的免疫調(diào)節(jié)作用。趨化因子結(jié)合蛋白(Chemokine binding protein,CBP)是ORFV在感染早期表達的一種重要的毒力蛋白,在調(diào)控宿主免疫應答方面發(fā)揮重要的作用。DC作為體內(nèi)唯一一個能夠直接刺激初始T細胞活化增殖的抗原呈遞細胞(antigen presenting cell,APC),在免疫調(diào)節(jié)和介導外周性免疫耐受中發(fā)揮重要的免疫應答作用。目前關于體外條件下ORFV及其毒力蛋白CBP作用于小鼠骨髓源DC的研究甚少。因此,本實驗通過表達純化原核蛋白CBP;通過表面標志物、細胞因子等試驗檢測ORFV及蛋白CBP是否促進DCs細胞的分化和成熟;最后對ORFV及CBP作用前、后引起DCs的差異基因進行分析驗證。本試驗為研究ORFV與宿主免疫細胞的相互作用提供理論依據(jù),為進一步闡釋ORFV感染宿主的免疫調(diào)節(jié)機制奠定基礎。取得的結(jié)論如下:1、構(gòu)建了pET-28a(+)-ORFV112原核表達載體,成功表達純化了該蛋白;2、成功制備了純度較高的DCs,不同濃度的羊口瘡病毒均能夠極顯著的促進DCs表面共刺激分子CD86、CD40的表達,顯著增加IL-1β、IL-6、IL-12以及TNF-α等細胞因子的分泌量;100ng CBP蛋白作用DCs后共刺激分子和細胞因子均顯著增加,與病毒作用DC后所產(chǎn)生的效果相類似。另外羊口瘡病毒及100ng CBP蛋白均能夠促進小鼠DC的成熟并誘導T細胞向Th1方向分化,以及促進T細胞釋放IFN-γ細胞因子來增加機體對外來病原體的殺傷作用。3、采用RNA-seq測序技術對ORFV和CBP蛋白作用后的DC的基因表達水平進行檢測,結(jié)果表明ORFV刺激DCs組與未刺激組相比,共有8241個差異基因,上調(diào)基因4205個,下調(diào)基因4036個;CBP刺激DC后與未刺激的細胞相比,共有7301個差異基因,上調(diào)基因3535個,下調(diào)基因3766個。差異基因分析結(jié)果顯示,共同變化的差異基因主要集中于細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路、抗原遞呈與加工過程、T細胞受體信號通路以及細胞周期和凋亡等途徑中。4、RT-PCR結(jié)果顯示共同差異基因CD8B、Ctse、IL2RA、Atp5e、CD80、Lck、CCL8與DC組相比,均為顯著上調(diào),基因Cstb、Akt、CCR1與DC組相比,均為顯著下調(diào),與RNA-seq測序結(jié)果一致。
【學位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

12物（見圖 2.2）；用限制性的片段。圖 2.1 ORFV-112 基因擴增結(jié)果.2.1 Amplification of ORFV-112NA Marker DL 2000；1：PCRA Marker DL 2000；1：Amplification

13聲處理后，離心收集上清及沉淀，表明 pET-28a-CBP 蛋白在上清和沉.4 重組蛋白 pET-28a-CBP 的 SDS-PAGE 分S-PAGE analysis of recombinant protein pET誘導 pET-28a-CBP 表達菌；2-4：經(jīng) IPTGarker；1：Non-induced recombinant bacteriT-28a-CBP under inducing conditions by IPT

組質(zhì)粒的小劑量誘導誘導、誘導樣品 pET-28a-CBP 表達菌進行 SDS-PAGE 可知，pET-28a-CBP 經(jīng)誘目的蛋白表達，且其大小與預期相符（見圖 2.4）圖 2.3 pET-28a-CBP 質(zhì)粒的雙酶切鑒Fig.2.3 Identification of pET-28a-CBP digested wXho ⅠM:DNA Marker DL 5000；1：pET-28a-CBP 質(zhì)2：空載體雙酶切產(chǎn)物M:DNA Marker DL 5000; 1: double digestiopET-28a-CBP plasmid; 2: double digestion provector圖 2.2 pET-28a-CBP 質(zhì)粒的 PCR 鑒定.2.2 Identification of pET-28a-CBP by PRCA Marker DL 2000；1-2：PCR 產(chǎn)物；3：陰性對照A Marker DL 2000；1-2：Amplification ofPCR；3：Negative control
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本文編號：2880794