發(fā)布時(shí)間：2020-11-12 08:35

　　 致瀉性牛大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)是引起犢牛腹瀉疾病(Neonatal calf diarrhea,NCD)的主要病原,對(duì)犢牛的發(fā)育、生長(zhǎng)、成活等造成很大的影響;牛多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,PM)會(huì)導(dǎo)致牛發(fā)生全身出血性敗血癥和牛呼吸道綜合征,也可導(dǎo)致腹瀉,該菌主要表現(xiàn)為混合感染和繼發(fā)感染,偶爾也有急性發(fā)病。這兩種菌在國(guó)內(nèi)牛場(chǎng)中普遍存在,兩者之間經(jīng)常發(fā)生混合感染,從而加劇腹瀉病的發(fā)生,給奶牛和肉牛產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)目前尚未有針對(duì)牛大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌病的聯(lián)合疫苗,本研究利用從臨床上分離的致病性牛大腸桿菌病原和牛多殺性巴氏桿菌病原,通過對(duì)病原進(jìn)行鑒定,建立菌種種子批,研制出二聯(lián)滅活疫苗,用于預(yù)防牛的大腸桿菌病和多殺性巴氏桿菌病。同時(shí)通過摸索疫苗的大生產(chǎn)工藝條件,完善疫苗的質(zhì)量特性研究,使研制的疫苗具有臨床應(yīng)用價(jià)值,為疫苗的產(chǎn)業(yè)化提供基礎(chǔ)。首先本研究從患有腹瀉疾病的犢牛上分離到兩株細(xì)菌,通過生物學(xué)鑒定為O101:K99致病性牛大腸桿菌病原和莢膜B群牛多殺性巴氏桿菌,分別命名為E0803株和P0604株。毒力試驗(yàn)結(jié)果顯示E0803株對(duì)小鼠的LD_(50)為9×10~6 CFU,無法使新西蘭兔致病;P0604株對(duì)小鼠和新西蘭兔的MLD均低于10 CFU。小鼠免疫原性試驗(yàn)表明,對(duì)照組小鼠全部死亡時(shí),E0803株免疫組能獲得80%的保護(hù)率,P0604株免疫組可獲得100%的保護(hù)率,提示兩株菌株均具有良好的免疫原性,可作為制備疫苗的候選菌株。建立了兩株菌株的種子批,不同代次菌株的生物學(xué)特性研究結(jié)果顯示,兩株菌株F1~F20各代次之間的培養(yǎng)特性、形態(tài)及純粹性均保持一致,F1、F10、F20各代次菌株生化特性、毒力和免疫原性均無明顯差異。實(shí)際應(yīng)用中建議將兩株菌株的第1~4代作為原始種子代次,第5~10代作為基礎(chǔ)種子代次,種子繼代培養(yǎng)控制在5代以內(nèi)。在二聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)工藝研究方面,對(duì)培養(yǎng)基選擇、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)血清添加量、大生產(chǎn)工藝條件、滅活工藝、乳化工藝等進(jìn)行研究,確定兩株菌株均可采用TSB進(jìn)行生產(chǎn)。在大生產(chǎn)發(fā)酵過程中,兩者的培養(yǎng)條件均為37℃下培養(yǎng)10 h,罐壓0.03 MPa,其中E0803株可調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min,P0604株采用攪拌轉(zhuǎn)速100r/min,同時(shí)在培養(yǎng)時(shí)添加2%~5%的血清進(jìn)行培養(yǎng)。確定兩株菌株大生產(chǎn)時(shí)的最佳滅活條件為采用0.2%甲醛溶液,在37℃條件下滅活24~36 h。確定疫苗配苗水油比例為1:2,小型乳化機(jī)乳化條件為8000 r/min乳化5 min,中大型乳化機(jī)乳化條件為4000r/min乳化20 min。在疫苗安全性方面,同時(shí)采用新西蘭兔和小鼠進(jìn)行牛大腸桿菌病、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗的安全性研究。結(jié)果顯示,牛大腸桿菌病、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗對(duì)兔和小鼠進(jìn)行超劑量一次接種及單劑量重復(fù)接種均安全,動(dòng)物接種疫苗后沒有出現(xiàn)因疫苗引起的不良反應(yīng);采用小鼠替代靶動(dòng)物建立二聯(lián)滅活疫苗的效力檢測(cè)方法,小鼠免疫后進(jìn)行攻毒,結(jié)果顯示,小鼠免疫疫苗后14日可產(chǎn)生免疫力,免疫21日后小鼠用強(qiáng)毒攻擊能獲得80%以上的保護(hù),表明本課題研究的牛大腸桿菌病、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗具有良好的安全性和有效性。上述研究成果為牛大腸桿菌病、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗的研制提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),為疫苗的產(chǎn)業(yè)化提供基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

15圖2-1 大腸桿菌在TSA培養(yǎng)圖 圖2-2 多殺性巴氏桿菌在鮮血瓊脂培養(yǎng)圖圖2-3 大腸桿菌革蘭氏染色圖 圖2-4 多殺性巴氏桿菌革蘭氏染色圖2.3.2 生化反應(yīng)生化反應(yīng)結(jié)果（表2-3）顯示，E0803株能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、鼠李糖、山梨醇和甘露醇，不能發(fā)酵衛(wèi)茅醇和肌醇，MR試驗(yàn)陽性，枸櫞酸鹽、明膠液化、H2S和VP試驗(yàn)為陰性。P0604株能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、山梨醇和甘露醇，不能發(fā)酵乳糖、麥芽糖、鼠李糖、衛(wèi)茅醇和肌醇，明膠液化、H2S試驗(yàn)陽性，枸櫞酸鹽、MR和VP試驗(yàn)為陰性。從生化試驗(yàn)結(jié)果可以看出，E0803株符合大腸埃希菌的生化反應(yīng)特性

15圖2-1 大腸桿菌在TSA培養(yǎng)圖 圖2-2 多殺性巴氏桿菌在鮮血瓊脂培養(yǎng)圖圖2-3 大腸桿菌革蘭氏染色圖 圖2-4 多殺性巴氏桿菌革蘭氏染色圖2.3.2 生化反應(yīng)生化反應(yīng)結(jié)果（表2-3）顯示，E0803株能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、鼠李糖、山梨醇和甘露醇，不能發(fā)酵衛(wèi)茅醇和肌醇，MR試驗(yàn)陽性，枸櫞酸鹽、明膠液化、H2S和VP試驗(yàn)為陰性。P0604株能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、山梨醇和甘露醇，不能發(fā)酵乳糖、麥芽糖、鼠李糖、衛(wèi)茅醇和肌醇，明膠液化、H2S試驗(yàn)陽性，枸櫞酸鹽、MR和VP試驗(yàn)為陰性。從生化試驗(yàn)結(jié)果可以看出，E0803株符合大腸埃希菌的生化反應(yīng)特性

15圖2-1 大腸桿菌在TSA培養(yǎng)圖 圖2-2 多殺性巴氏桿菌在鮮血瓊脂培養(yǎng)圖圖2-3 大腸桿菌革蘭氏染色圖 圖2-4 多殺性巴氏桿菌革蘭氏染色圖2.3.2 生化反應(yīng)生化反應(yīng)結(jié)果（表2-3）顯示，E0803株能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、鼠李糖、山梨醇和甘露醇，不能發(fā)酵衛(wèi)茅醇和肌醇，MR試驗(yàn)陽性，枸櫞酸鹽、明膠液化、H2S和VP試驗(yàn)為陰性。P0604株能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、山梨醇和甘露醇，不能發(fā)酵乳糖、麥芽糖、鼠李糖、衛(wèi)茅醇和肌醇，明膠液化、H2S試驗(yàn)陽性，枸櫞酸鹽、MR和VP試驗(yàn)為陰性。從生化試驗(yàn)結(jié)果可以看出，E0803株符合大腸埃希菌的生化反應(yīng)特性
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 方光遠(yuǎn);茅慧華;蔣加進(jìn);顧亞鳳;晏文梅;戴鼎震;郭宇飛;;不同病例動(dòng)物源大腸桿菌的分離鑒定及16S rDNA同源性分析[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2015年12期

2 王梓;孔令聰;賈博巖;劉樹明;馬紅霞;;7株牛源A型巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J];中國(guó)獸藥雜志;2015年07期

3 何雪陽;閆曉玲;;一起犢牛發(fā)生混合感染性腹瀉病的診治[J];中國(guó)牛業(yè)科學(xué);2015年04期

4 李書光;張娜;王玉茂;李峰;林初文;沈志強(qiáng);李金林;;一株血清型O101多重耐藥牛致病性大腸桿菌菌株的分離鑒定[J];家畜生態(tài)學(xué)報(bào);2015年02期

5 張媛;魏財(cái)文;李建;李偉杰;蔣玉文;;多重PCR在多殺性巴氏桿菌莢膜定群中的應(yīng)用[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2014年12期

6 楊克禮;李傳友;郭銳;段正贏;田永祥;;規(guī)�；�牛場(chǎng)致病性大腸桿菌的分離與鑒定[J];湖北畜牧獸醫(yī);2014年10期

7 方光遠(yuǎn);張莉;陸宇超;顧亞鳳;戴鼎震;;犢牛腹瀉大腸桿菌的分離鑒定和耐藥性檢測(cè)[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2014年09期

8 黃龍;劉溪源;趙世媛;高菊梅;李永琴;許立華;;牛群大腸桿菌與巴氏桿菌混合感染的診斷與控制[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2014年14期

9 楊寶鳳;李能章;鄒靈秀;黃園媛;吳建云;王自力;魏學(xué)良;彭遠(yuǎn)義;;6株牛源A型多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年06期

10 賀奮義;魏玉明;郭慧琳;孟林明;何彥春;張文波;;河西走廊牛源A型多殺性巴氏桿菌滅活疫苗的制備及臨床效果檢測(cè)觀察[J];畜牧獸醫(yī)雜志;2014年03期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 馬建偉;牛源多殺性巴氏桿菌交叉保護(hù)性抗原的篩選及其融合蛋白免疫效果的研究[D];西南大學(xué);2015年

2 黃先奇;豬源多殺性巴氏桿菌體內(nèi)表達(dá)基因的篩選及間接ELISA方法的建立[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2880523