發(fā)布時(shí)間：2019-07-24 06:19

【摘要】：本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)評(píng)價(jià)了抗凍蛋白Ⅲ(AFPⅢ)對山羊精子的冷凍保護(hù)效果。采用假陰道法采集6只云南黑山羊精液,離心洗滌去除精漿后和冷凍稀釋液(0、0.1、1、10、100μg/m L AFPⅢ)混合,經(jīng)4℃平衡、液氮?dú)庀囝A(yù)凍后直接投入液氮保存。解凍后檢測精子活力、頂體、質(zhì)膜以及早期凋亡等指標(biāo)。同時(shí)采用透射電鏡(TEM)觀察冷凍對精子超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明:與對照組相比,AFPⅢ并不能顯著改善山羊解凍后精子活力、頂體完整性、質(zhì)膜完整性和低滲耐受性(P0.05)。此外,AFPⅢ并不能抑制解凍后精子的磷脂酰絲氨酸(PS)外翻。電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),AFPⅢ并不能有效保護(hù)冷凍精子質(zhì)膜。總之,本實(shí)驗(yàn)證實(shí),AFPⅢ并不能降低山羊精子的冷凍損傷,相反其可能加重冷凍對精子質(zhì)膜的損傷,其損傷機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。
【圖文】：

彡鼻暗納窖蚨塵鄵譜鞒絳頡?本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在冷凍稀釋液中添加AFPⅢ并不能降低冷凍對山羊精子活力和頂體的損傷；而且隨著抗凍蛋白濃度的增加，解凍后精子的活力呈逐步加重的趨勢。然而國外的一些研究表明，AFP可以對哺乳動(dòng)物精子提供一定的冷凍保護(hù)作用。例如，AFPⅢ可以提高靈長類動(dòng)物精子解凍后的活力[11]。此外，AFP能夠提高綿羊冷凍精子的頂體完整性[8]。造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的原因可能是由于動(dòng)物種類不同或采用的AFP產(chǎn)品不同。然而，爭議性的結(jié)果仍然存在。在小鼠上，Koshimoto等[10]得出了與本研究圖5AFPⅢ對山羊冷凍精子超微結(jié)構(gòu)的影響A和B：冷凍對精子質(zhì)膜和頂體的影響；C：不含AFPⅢ冷凍組精子的超微結(jié)構(gòu)；D：AFPⅢ冷凍組（10μg/mL）精子的超微結(jié)構(gòu)類似的結(jié)論。開始他們認(rèn)為AFP可以抑制重結(jié)晶從而緩解精子細(xì)胞的冷凍損傷。然而，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度（1~100μg/mL）的AFPI、AFPⅢ或抗凍糖蛋白并不能有效地保護(hù)小鼠冷凍精子；相反，隨著AFP濃度的升高，解凍后小鼠精子的存活率呈逐步下降的趨勢。此外，本研究發(fā)現(xiàn)AFPⅢ無法降低冷凍解凍過程對山羊精子質(zhì)膜的損傷。TEM實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。解凍后精子質(zhì)膜完整率隨著AFPⅢ濃度的升高呈逐步下降的趨勢。此外，AFPⅢ也不能抑制冷凍解凍過程導(dǎo)致的質(zhì)膜PS外翻。眾所周知，PS外翻是細(xì)胞早期凋亡的一個(gè)重要標(biāo)志，這表明AFPⅢ不能防止冷凍精子的早期凋亡。隨著AFPⅢ濃度的升高，解凍后精子的PS標(biāo)記率呈逐步增加的趨勢，當(dāng)AFPⅢ濃度提高至1%時(shí)，其PS標(biāo)記率在60%以上，而且大部分是晚期凋亡細(xì)胞，這從另一個(gè)側(cè)面反映了冷凍嚴(yán)重破壞了精子質(zhì)膜的完整性。HOST實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AFPⅢ并不能提高山羊冷凍精子的低滲耐受性。根據(jù)目前的報(bào)道，精子的低滲耐受性和其受?

-55-2017年第53卷第3期ScienceandTechnology·科學(xué)技術(shù)的頂體完整性。最右側(cè)亞群代表頂體完整性最好的精子群，而其他2個(gè)亞群代表頂體部分完整的精子細(xì)胞群。隨著AFPⅢ濃度的增加，冷凍精子的頂體完整基本維持在58%左右，而且各處理組之間差異不顯著（P>0.05）。AFPⅢ對冷凍精子質(zhì)膜和磷脂酰絲氨酸（PS）分布的影響見圖3。流式分析散點(diǎn)圖顯示，解凍后精子經(jīng)AnnexinV-FITC和碘化丙啶（PI）雙標(biāo)后分為4個(gè)細(xì)胞亞群。左下角細(xì)胞群代表正常精子（AnnexinV和PI均陰性）；右下角細(xì)胞群代表早期凋亡細(xì)胞群（AnnexinV陽性，PI陰性）；左上角細(xì)胞群代表壞死細(xì)胞（AnnexinV陰性，PI陽性）；右上角細(xì)胞群代表晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV和PI陽性）。圖3A表明，隨著AFPⅢ濃度的升高，精子的質(zhì)膜完整性呈逐步下降的趨勢。當(dāng)冷凍稀釋液中不含AFPⅢ時(shí)，其質(zhì)膜完整率為（49.51±6.53）%。當(dāng)AFPⅢ濃度提高至0.1μg/mL時(shí)，其質(zhì)膜完整率驟降至（38.42±8.49）%，顯著低于不加AFPⅢ處理組（P<0.05）。當(dāng)AFPⅢ濃度為10μg/mL時(shí)，解凍后精子質(zhì)膜完整率僅為20%左右，與不加AFPⅢ組差異極顯著（P<0.01）。此外，AFPⅢ并不能防止冷凍導(dǎo)致的精子質(zhì)膜PS外翻。如圖3B所示，當(dāng)AFPⅢ濃度為0.1μg/mL時(shí)，精子PS標(biāo)記率顯著高于不添加AFPⅢ冷凍組（53.19%vs42.71%，，P<0.05）。當(dāng)AFPⅢ濃度進(jìn)一步提高至10μg/mL時(shí)，其PS標(biāo)記率在60%以上，與不加AFPIII冷凍組差異極顯著（P<0.01）。AFPⅢ對山羊冷凍精子低滲耐受性的影響見圖4。隨著抗凍蛋白濃度的升高，解凍后精子低滲耐受性呈逐步下降的趨勢。當(dāng)AFPⅢ濃度為1μg/mL時(shí)，精子彎尾率為（30.38±7.45）%，顯著低于不加AFPⅢ冷凍組精子（P<0.05）。當(dāng)AFPⅢ濃度進(jìn)一步提高至10μg/mL時(shí)，解凍后精子彎尾率僅為25%左右?
【作者單位】： 云南省畜禽遺傳資源保護(hù)和種質(zhì)創(chuàng)新工程實(shí)驗(yàn)室云南省肉羊工程技術(shù)研究中心云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院;魯?shù)榭h畜牧獸醫(yī)局;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(31360551、31560635) 云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2016FB042) 云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃(2014HB051) 云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014BB014) 云南省高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展項(xiàng)目計(jì)劃(201404) 家養(yǎng)動(dòng)物種質(zhì)資源平臺(tái)
【分類號(hào)】：S827

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本文編號(hào)：2518445