發(fā)布時間：2019-07-24 06:19

【摘要】：為分析抗貝氏隱孢子蟲的免疫機制,本研究將純化的貝氏隱孢子蟲卵囊經(jīng)處理后制備成免疫抗原,經(jīng)雞翅下及大腿內(nèi)側(cè)肌肉多點注射免疫6次150日齡產(chǎn)蛋海蘭雞,每次免疫間隔為15~20 d,以制備特異性抗貝氏隱孢子蟲(Cryptosporidium baileyi)卵黃免疫球蛋白(IgY)。結(jié)果顯示,初次免疫后第120天,IgY效價達到1∶25 600,經(jīng)免疫熒光法鑒定可識別貝氏隱孢子蟲卵囊。用間接ELISA和間接免疫熒光試驗比較測定IgY抗體對貝氏隱孢子蟲、牛安氏隱孢子蟲、豬等孢球蟲及豬弓形蟲的抗原發(fā)現(xiàn),得到的IgY抗體能特異性識別貝氏隱孢子蟲。間接ELISA法測定不同溫度、不同pH下IgY的活性發(fā)現(xiàn),制備的IgY抗體具有較好的熱穩(wěn)定性和一定的耐酸、耐堿性。以上結(jié)果表明,貝氏隱孢子蟲卵囊抗原免疫蛋雞可制備高質(zhì)量的特異性IgY抗體,這為進一步應(yīng)用抗隱孢子蟲特異性IgY抗體治療與診斷隱孢子蟲病奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

第7期崔朝輝等：抗貝氏隱孢子蟲卵黃抗體的制備與鑒定圖3IgY抗體與血清抗體水平動態(tài)監(jiān)測Fig.3Time-dependentchangesinthetitersofIgYandan-tibodiesinserumofimmunedchicken圖1IgY純化的SDS-PAGE分析Fig.1SDS-PAGEanalysisofthepurifiedIgYM：蛋白分子質(zhì)量標準；1～2：粗提純IgY；3～4：未提純IgY；5～6：已純化的IgYM：ProteinMarker；1-2：IncompletelypurifiedIgY；3-4：UnpurifiedIgY；5-6：PurifiedIgY蟲、豬源弓形蟲等原蟲的可溶性蛋白抗原包被96孔酶標板。同時設(shè)貝氏隱孢子蟲可溶性蛋白抗原作為陽性對照，用免疫雞的抗貝氏隱孢子蟲卵黃液作為一抗經(jīng)倍比稀釋，用上述ELISA方法測定效價，比較IgY的特異性。1.8間接免疫熒光試驗（IFA）測定IgY的特異性參照1.7制備的熒光抗體染色標本步驟，用牛安氏隱孢子蟲（C.andersoni）載玻片固定制作熒光染色標本，與貝氏隱孢子蟲同步進行IgY的特異性測定，用上述免疫后純化好的IgY進行間接免疫熒光試驗，并用免疫前的IgY作為陰性對照，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。1.9熱穩(wěn)定性試驗將IgY稀釋成1mg/mL，，各別取0.5mL，分別放入25、37、45、55、65、70、75和80℃水浴中加熱15min后，立即放入冰水混合物中冷卻，用ELISA測定各處理樣品的效價。1.10耐酸堿性試驗分別用pH值為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的PBS緩沖液（0.01mol/L，pH7.4）將IgY抗體稀釋為0.5mg/mL，并調(diào)至相對應(yīng)的pH值，置37℃恒溫箱孵育2h，然后用NaOH和HCl再分別將樣品的pH值調(diào)至7.2～7.4，用ELISA測定抗體樣品的效價。2結(jié)果2.1純化后IgY濃度的測定將收集的初次免疫后第120～150天的卵黃抗體經(jīng)提娶鹽析、透析等純化后，用Bradford法測得IgY的質(zhì)量濃度為9.44mg/mL。2.2IgY的SDS-PAGE和間接免疫熒光分析?

第7期崔朝輝等：抗貝氏隱孢子蟲卵黃抗體的制備與鑒定圖3IgY抗體與血清抗體水平動態(tài)監(jiān)測Fig.3Time-dependentchangesinthetitersofIgYandan-tibodiesinserumofimmunedchicken圖1IgY純化的SDS-PAGE分析Fig.1SDS-PAGEanalysisofthepurifiedIgYM：蛋白分子質(zhì)量標準；1～2：粗提純IgY；3～4：未提純IgY；5～6：已純化的IgYM：ProteinMarker；1-2：IncompletelypurifiedIgY；3-4：UnpurifiedIgY；5-6：PurifiedIgY蟲、豬源弓形蟲等原蟲的可溶性蛋白抗原包被96孔酶標板。同時設(shè)貝氏隱孢子蟲可溶性蛋白抗原作為陽性對照，用免疫雞的抗貝氏隱孢子蟲卵黃液作為一抗經(jīng)倍比稀釋，用上述ELISA方法測定效價，比較IgY的特異性。1.8間接免疫熒光試驗（IFA）測定IgY的特異性參照1.7制備的熒光抗體染色標本步驟，用牛安氏隱孢子蟲（C.andersoni）載玻片固定制作熒光染色標本，與貝氏隱孢子蟲同步進行IgY的特異性測定，用上述免疫后純化好的IgY進行間接免疫熒光試驗，并用免疫前的IgY作為陰性對照，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。1.9熱穩(wěn)定性試驗將IgY稀釋成1mg/mL，各別取0.5mL，分別放入25、37、45、55、65、70、75和80℃水浴中加熱15min后，立即放入冰水混合物中冷卻，用ELISA測定各處理樣品的效價。1.10耐酸堿性試驗分別用pH值為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的PBS緩沖液（0.01mol/L，pH7.4）將IgY抗體稀釋為0.5mg/mL，并調(diào)至相對應(yīng)的pH值，置37℃恒溫箱孵育2h，然后用NaOH和HCl再分別將樣品的pH值調(diào)至7.2～7.4，用ELISA測定抗體樣品的效價。2結(jié)果2.1純化后IgY濃度的測定將收集的初次免疫后第120～150天的卵黃抗體經(jīng)提娶鹽析、透析等純化后，用Bradford法測得IgY的質(zhì)量濃度為9.44mg/mL。2.2IgY的SDS-PAGE和間接免疫熒光分析?
【作者單位】： 河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院河南省人獸共患病國際聯(lián)合實驗室;
【基金】：河南省科技創(chuàng)新杰出人才計劃項目(34200510012) 十二五國家科技重大專項(2012ZX10004220-011)
【分類號】：S852.723

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本文編號：2518444