發(fā)布時(shí)間：2019-07-24 06:19

【摘要】：為分析抗貝氏隱孢子蟲的免疫機(jī)制,本研究將純化的貝氏隱孢子蟲卵囊經(jīng)處理后制備成免疫抗原,經(jīng)雞翅下及大腿內(nèi)側(cè)肌肉多點(diǎn)注射免疫6次150日齡產(chǎn)蛋海蘭雞,每次免疫間隔為15~20 d,以制備特異性抗貝氏隱孢子蟲(Cryptosporidium baileyi)卵黃免疫球蛋白(IgY)。結(jié)果顯示,初次免疫后第120天,IgY效價(jià)達(dá)到1∶25 600,經(jīng)免疫熒光法鑒定可識(shí)別貝氏隱孢子蟲卵囊。用間接ELISA和間接免疫熒光試驗(yàn)比較測(cè)定IgY抗體對(duì)貝氏隱孢子蟲、牛安氏隱孢子蟲、豬等孢球蟲及豬弓形蟲的抗原發(fā)現(xiàn),得到的IgY抗體能特異性識(shí)別貝氏隱孢子蟲。間接ELISA法測(cè)定不同溫度、不同pH下IgY的活性發(fā)現(xiàn),制備的IgY抗體具有較好的熱穩(wěn)定性和一定的耐酸、耐堿性。以上結(jié)果表明,貝氏隱孢子蟲卵囊抗原免疫蛋雞可制備高質(zhì)量的特異性IgY抗體,這為進(jìn)一步應(yīng)用抗隱孢子蟲特異性IgY抗體治療與診斷隱孢子蟲病奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

第7期崔朝輝等：抗貝氏隱孢子蟲卵黃抗體的制備與鑒定圖3IgY抗體與血清抗體水平動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)Fig.3Time-dependentchangesinthetitersofIgYandan-tibodiesinserumofimmunedchicken圖1IgY純化的SDS-PAGE分析Fig.1SDS-PAGEanalysisofthepurifiedIgYM：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2：粗提純IgY；3～4：未提純IgY；5～6：已純化的IgYM：ProteinMarker；1-2：IncompletelypurifiedIgY；3-4：UnpurifiedIgY；5-6：PurifiedIgY蟲、豬源弓形蟲等原蟲的可溶性蛋白抗原包被96孔酶標(biāo)板。同時(shí)設(shè)貝氏隱孢子蟲可溶性蛋白抗原作為陽性對(duì)照，用免疫雞的抗貝氏隱孢子蟲卵黃液作為一抗經(jīng)倍比稀釋，用上述ELISA方法測(cè)定效價(jià)，比較IgY的特異性。1.8間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）測(cè)定IgY的特異性參照1.7制備的熒光抗體染色標(biāo)本步驟，用牛安氏隱孢子蟲（C.andersoni）載玻片固定制作熒光染色標(biāo)本，與貝氏隱孢子蟲同步進(jìn)行IgY的特異性測(cè)定，用上述免疫后純化好的IgY進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，并用免疫前的IgY作為陰性對(duì)照，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。1.9熱穩(wěn)定性試驗(yàn)將IgY稀釋成1mg/mL，，各別取0.5mL，分別放入25、37、45、55、65、70、75和80℃水浴中加熱15min后，立即放入冰水混合物中冷卻，用ELISA測(cè)定各處理樣品的效價(jià)。1.10耐酸堿性試驗(yàn)分別用pH值為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的PBS緩沖液（0.01mol/L，pH7.4）將IgY抗體稀釋為0.5mg/mL，并調(diào)至相對(duì)應(yīng)的pH值，置37℃恒溫箱孵育2h，然后用NaOH和HCl再分別將樣品的pH值調(diào)至7.2～7.4，用ELISA測(cè)定抗體樣品的效價(jià)。2結(jié)果2.1純化后IgY濃度的測(cè)定將收集的初次免疫后第120～150天的卵黃抗體經(jīng)提娶鹽析、透析等純化后，用Bradford法測(cè)得IgY的質(zhì)量濃度為9.44mg/mL。2.2IgY的SDS-PAGE和間接免疫熒光分析?

第7期崔朝輝等：抗貝氏隱孢子蟲卵黃抗體的制備與鑒定圖3IgY抗體與血清抗體水平動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)Fig.3Time-dependentchangesinthetitersofIgYandan-tibodiesinserumofimmunedchicken圖1IgY純化的SDS-PAGE分析Fig.1SDS-PAGEanalysisofthepurifiedIgYM：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2：粗提純IgY；3～4：未提純IgY；5～6：已純化的IgYM：ProteinMarker；1-2：IncompletelypurifiedIgY；3-4：UnpurifiedIgY；5-6：PurifiedIgY蟲、豬源弓形蟲等原蟲的可溶性蛋白抗原包被96孔酶標(biāo)板。同時(shí)設(shè)貝氏隱孢子蟲可溶性蛋白抗原作為陽性對(duì)照，用免疫雞的抗貝氏隱孢子蟲卵黃液作為一抗經(jīng)倍比稀釋，用上述ELISA方法測(cè)定效價(jià)，比較IgY的特異性。1.8間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）測(cè)定IgY的特異性參照1.7制備的熒光抗體染色標(biāo)本步驟，用牛安氏隱孢子蟲（C.andersoni）載玻片固定制作熒光染色標(biāo)本，與貝氏隱孢子蟲同步進(jìn)行IgY的特異性測(cè)定，用上述免疫后純化好的IgY進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，并用免疫前的IgY作為陰性對(duì)照，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。1.9熱穩(wěn)定性試驗(yàn)將IgY稀釋成1mg/mL，各別取0.5mL，分別放入25、37、45、55、65、70、75和80℃水浴中加熱15min后，立即放入冰水混合物中冷卻，用ELISA測(cè)定各處理樣品的效價(jià)。1.10耐酸堿性試驗(yàn)分別用pH值為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的PBS緩沖液（0.01mol/L，pH7.4）將IgY抗體稀釋為0.5mg/mL，并調(diào)至相對(duì)應(yīng)的pH值，置37℃恒溫箱孵育2h，然后用NaOH和HCl再分別將樣品的pH值調(diào)至7.2～7.4，用ELISA測(cè)定抗體樣品的效價(jià)。2結(jié)果2.1純化后IgY濃度的測(cè)定將收集的初次免疫后第120～150天的卵黃抗體經(jīng)提娶鹽析、透析等純化后，用Bradford法測(cè)得IgY的質(zhì)量濃度為9.44mg/mL。2.2IgY的SDS-PAGE和間接免疫熒光分析?
【作者單位】： 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院河南省人獸共患病國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：河南省科技創(chuàng)新杰出人才計(jì)劃項(xiàng)目(34200510012) 十二五國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2012ZX10004220-011)
【分類號(hào)】：S852.723

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周春香;蔡進(jìn)忠;李春花;張龍現(xiàn);何國(guó)聲;;牦牛隱孢子蟲(Cryptospordiun in Yak)研究進(jìn)展[J];青海畜牧獸醫(yī)雜志;2009年06期

2 彭昊;李軍;陶立;陳澤祥;韋志鋒;許力干;楊威;;牛隱孢子蟲多重PCR方法的建立及應(yīng)用[J];中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào);2012年08期

3 張冰;張杰;許杰;何惠君;巴圖艾德尼;;隱孢子蟲檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J];中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué);2014年02期

4 何宏軒 ,張曉龍;CP15-DNA免疫母畜對(duì)幼畜抗微小隱孢子蟲感染的保護(hù)性研究[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));2000年03期

5 章達(dá)明,黃錦光;廣州市豬牛感染隱孢子蟲調(diào)查[J];中國(guó)人獸共患病雜志;2001年02期

6 楊麗君,禹濱,楊武雄;種雞感染隱孢子蟲的鑒定[J];中國(guó)獸醫(yī)寄生蟲病;2001年04期

7 王權(quán),周金林,錢應(yīng)娟,陳永軍,張惠英,周勇志,王永康,徐新紅;套式PCR檢測(cè)奶牛糞便中隱孢子蟲[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2002年06期

8 胡俊杰,左仰賢;家畜禽隱孢子蟲研究簡(jiǎn)況[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2002年05期

9 孫銘飛,張龍現(xiàn),寧長(zhǎng)申,閆文朝,王進(jìn)產(chǎn),李慧琴;禽類隱孢子蟲研究進(jìn)展[J];中國(guó)人獸共患病雜志;2005年06期

10 武林,李培英;隱孢子蟲致病機(jī)理的研究進(jìn)展[J];中國(guó)獸醫(yī)寄生蟲病;2005年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 彭昊;李軍;陶立;陳澤祥;唐林生;韋志鋒;馬春霞;謝宇舟;yば郾

本文編號(hào)：2518444