發(fā)布時(shí)間：2019-07-20 20:07

【摘要】：輪狀病毒(Rotavirus,RV)是重要的人畜共患病原之一,腹瀉和嘔吐為其主要引起的典型臨床癥狀。輪狀病毒的存在,不僅嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展,同時(shí)也威脅到人類的安全,引起嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失,成為科學(xué)研究的焦點(diǎn)。本研究將以豬輪狀病毒(Procine Rotavirus,PRV)結(jié)構(gòu)蛋白VP3的C端結(jié)構(gòu)域(VP3-CTD)作為主要研究對(duì)象,通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法分析其在病毒致病性和免疫逃逸方面的作用。研究表明人源VP3-CTD對(duì)RV的致病性有重要影響。同時(shí),該區(qū)域還具有2’,5’-磷酸二酯酶(2’-5’PDEs)的活性,可以通過切割由2’,5’-寡腺苷酸合成酶(2’,5’-oligoadenylate synthetase,OAS)合成的2’,5’-寡腺苷酸(2’-5’A)來抑制OAS-RNase L信號(hào)通路,使病毒逃逸宿主的先天性免疫致使機(jī)體發(fā)病。因此,通過研究PRV VP3-CTD的結(jié)構(gòu),可以進(jìn)一步了解PRV的致病和免疫逃逸的機(jī)制,為抗PRV的藥物的篩選奠定基礎(chǔ)。本研究首先對(duì)豬輪狀病毒VP3-CTD基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化,并將VP3-CTD基因克隆到原核表達(dá)載體p ET30a上進(jìn)行原核表達(dá)純化;在原核表達(dá)過程中對(duì)含有重組載體的Rosseta(DE3)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明在0.5mmol/L IPTG、18℃、180rpm/min、18h的條件下目的蛋白的可溶性良好,獲得了可溶性較高的蛋白;將表達(dá)的蛋白利用Ni2+柱親和層析和分子篩層析進(jìn)行純化,并通過超濾法得到了高濃度、高純度、非單體形式的VP3-CTD蛋白進(jìn)行后續(xù)的蛋白結(jié)晶實(shí)驗(yàn)的蛋白結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。在蛋白結(jié)晶條件篩選方面,本研究采用坐滴法進(jìn)行篩選。通過多種條件的篩選,我們發(fā)現(xiàn)在HR2-110試劑盒的36號(hào)條件下(0.1mo/L Tris-HCl p H 8.5,8%PEG8000)蛋白結(jié)晶狀況較好,最終通過進(jìn)一步的優(yōu)化得到晶體生長的最佳條件為0.15mol/L Tris-HCl p H 8.3、4%PEG8000、8%EG、60 days、20℃;在該條件下蛋白可以結(jié)晶成X射線衍射較強(qiáng)的規(guī)則長方體晶體,其晶體大小為15μm×15μm×200μm,通過X射線衍射實(shí)驗(yàn)得到晶體的分辨率為2.3?,并收取數(shù)據(jù)。利用分子置換法和多種晶體分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,解析出VP3-CTD的蛋白晶體結(jié)構(gòu)。通過分析表明VP3-CTD是以同源二聚體的形式存在,其單體結(jié)構(gòu)主要有2個(gè)α螺旋和7個(gè)β折疊組成,C端的β折疊形成一個(gè)凹槽,該蛋白的表面靜電勢(shì)顯示,凹槽主要帶正電荷,二聚體是兩分子VP3-CTD蛋白的凹槽互補(bǔ)嵌合的結(jié)構(gòu),中間形成一個(gè)帶較強(qiáng)正電荷的間隙,推測(cè)其為結(jié)合和切割帶負(fù)電荷的2’-5’A的區(qū)域�？傊�,本研究通過表達(dá)和純化PRV的VP3-CTD蛋白,并對(duì)其進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)的解析,進(jìn)一步揭示了其切割2’-5’A的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),為抗PRV藥物的篩選提供理論依據(jù)。
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015 屆碩士研究生學(xué)位論文 造成大量的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失。狀病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)病毒（PRV）病毒粒子大體呈圓形，直徑在 65 nm 和 75 nm 之間沒有囊膜，中央是芯髓的核心，呈六角形（侯美如等 2013），核射狀的光滑蛋白，排列成電子透明層（張鎮(zhèn)松和劉秀卿 2009）。下觀察其呈輪狀結(jié)構(gòu)的特征，，因此就命名該病毒為輪狀病毒。P電子顯微攝像技術(shù)，構(gòu)建輪狀病毒的三維結(jié)構(gòu)模型，結(jié)構(gòu)蛋白 成外層衣殼，VP6 構(gòu)成內(nèi)層衣殼，VP1、VP2 和 VP3 三種結(jié)構(gòu)蛋喬薪瑗 2008, 肖長峰等 2009），中央核心包裹 11 條病毒基因組髓的成分之一（圖 1.1）（Prasad et al 1988）。

圖 1.2 干擾素抗病毒分子機(jī)制（Han et al 2007Fig.1.2 Anti-viral mechanism of IFNTD 蛋白抑制 OAS-RNase L 信號(hào)通路的研究毒的VP3-CTD蛋白具有2’-5’磷酸二酯酶活性，它能揮關(guān)鍵作用的 2’-5’A（仝文斌和陶其敏 1998,Loppase L 不被激活，病毒的 mRNA 和 rRNA 不被切割天性免疫系統(tǒng)的圍捕，使宿主致�。▓D 1.3），并且變成精氨酸（VP3 H797R）后，2’-5’PDEs 活性明對(duì) OAS-RNase L 信號(hào)通路的更精細(xì)的反應(yīng)機(jī)2008, Han et al 2007）。而 PRV VP3-CTD 蛋白與人為研究 PRV VP3-CTD 結(jié)構(gòu)和功能提供依據(jù)。晶學(xué)研究
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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1 龐昕,柴家前,趙宏坤,姜仁輝;豬輪狀病毒感染研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2000年04期

2 張鎮(zhèn)松;劉秀卿;;318例腹瀉嬰幼兒糞便A群輪狀病毒的檢測(cè)與分析[J];河北醫(yī)學(xué);2009年06期

3 楊艷梅;李霞;楊慧;錢淵;張又;霍巖;方榮祥;陳曉英;;A組輪狀病毒多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位的串聯(lián)表達(dá)及其免疫原性的檢測(cè)[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2011年01期

4 王鵬雁,陳創(chuàng)夫,余興龍,徐興然,涂長春,張高軒;輪狀病毒VP4基因和VP7基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J];中國獸醫(yī)科技;2003年01期

5 初秀,許寶琴;仔豬輪狀病毒性腹瀉的診斷與防治[J];中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志;1998年05期

本文編號(hào)：2516890