發(fā)布時間：2019-07-20 20:07

【摘要】：輪狀病毒(Rotavirus,RV)是重要的人畜共患病原之一,腹瀉和嘔吐為其主要引起的典型臨床癥狀。輪狀病毒的存在,不僅嚴重影響畜牧業(yè)的發(fā)展,同時也威脅到人類的安全,引起嚴重經濟損失,成為科學研究的焦點。本研究將以豬輪狀病毒(Procine Rotavirus,PRV)結構蛋白VP3的C端結構域(VP3-CTD)作為主要研究對象,通過結構生物學方法分析其在病毒致病性和免疫逃逸方面的作用。研究表明人源VP3-CTD對RV的致病性有重要影響。同時,該區(qū)域還具有2’,5’-磷酸二酯酶(2’-5’PDEs)的活性,可以通過切割由2’,5’-寡腺苷酸合成酶(2’,5’-oligoadenylate synthetase,OAS)合成的2’,5’-寡腺苷酸(2’-5’A)來抑制OAS-RNase L信號通路,使病毒逃逸宿主的先天性免疫致使機體發(fā)病。因此,通過研究PRV VP3-CTD的結構,可以進一步了解PRV的致病和免疫逃逸的機制,為抗PRV的藥物的篩選奠定基礎。本研究首先對豬輪狀病毒VP3-CTD基因密碼子進行優(yōu)化,并將VP3-CTD基因克隆到原核表達載體p ET30a上進行原核表達純化;在原核表達過程中對含有重組載體的Rosseta(DE3)表達條件進行優(yōu)化,結果表明在0.5mmol/L IPTG、18℃、180rpm/min、18h的條件下目的蛋白的可溶性良好,獲得了可溶性較高的蛋白;將表達的蛋白利用Ni2+柱親和層析和分子篩層析進行純化,并通過超濾法得到了高濃度、高純度、非單體形式的VP3-CTD蛋白進行后續(xù)的蛋白結晶實驗的蛋白結晶實驗。在蛋白結晶條件篩選方面,本研究采用坐滴法進行篩選。通過多種條件的篩選,我們發(fā)現(xiàn)在HR2-110試劑盒的36號條件下(0.1mo/L Tris-HCl p H 8.5,8%PEG8000)蛋白結晶狀況較好,最終通過進一步的優(yōu)化得到晶體生長的最佳條件為0.15mol/L Tris-HCl p H 8.3、4%PEG8000、8%EG、60 days、20℃;在該條件下蛋白可以結晶成X射線衍射較強的規(guī)則長方體晶體,其晶體大小為15μm×15μm×200μm,通過X射線衍射實驗得到晶體的分辨率為2.3?,并收取數(shù)據(jù)。利用分子置換法和多種晶體分析軟件進行數(shù)據(jù)分析,解析出VP3-CTD的蛋白晶體結構。通過分析表明VP3-CTD是以同源二聚體的形式存在,其單體結構主要有2個α螺旋和7個β折疊組成,C端的β折疊形成一個凹槽,該蛋白的表面靜電勢顯示,凹槽主要帶正電荷,二聚體是兩分子VP3-CTD蛋白的凹槽互補嵌合的結構,中間形成一個帶較強正電荷的間隙,推測其為結合和切割帶負電荷的2’-5’A的區(qū)域�？傊�,本研究通過表達和純化PRV的VP3-CTD蛋白,并對其進行晶體結構的解析,進一步揭示了其切割2’-5’A的結構基礎,為抗PRV藥物的篩選提供理論依據(jù)。
【圖文】：

華中農業(yè)大學 2015 屆碩士研究生學位論文 造成大量的直接和間接經濟損失。狀病毒形態(tài)結構病毒（PRV）病毒粒子大體呈圓形，直徑在 65 nm 和 75 nm 之間沒有囊膜，中央是芯髓的核心，呈六角形（侯美如等 2013），核射狀的光滑蛋白，排列成電子透明層（張鎮(zhèn)松和劉秀卿 2009）。下觀察其呈輪狀結構的特征，，因此就命名該病毒為輪狀病毒。P電子顯微攝像技術，構建輪狀病毒的三維結構模型，結構蛋白 成外層衣殼，VP6 構成內層衣殼，VP1、VP2 和 VP3 三種結構蛋喬薪瑗 2008, 肖長峰等 2009），中央核心包裹 11 條病毒基因組髓的成分之一（圖 1.1）（Prasad et al 1988）。

圖 1.2 干擾素抗病毒分子機制（Han et al 2007Fig.1.2 Anti-viral mechanism of IFNTD 蛋白抑制 OAS-RNase L 信號通路的研究毒的VP3-CTD蛋白具有2’-5’磷酸二酯酶活性，它能揮關鍵作用的 2’-5’A（仝文斌和陶其敏 1998,Loppase L 不被激活，病毒的 mRNA 和 rRNA 不被切割天性免疫系統(tǒng)的圍捕，使宿主致�。▓D 1.3），并且變成精氨酸（VP3 H797R）后，2’-5’PDEs 活性明對 OAS-RNase L 信號通路的更精細的反應機2008, Han et al 2007）。而 PRV VP3-CTD 蛋白與人為研究 PRV VP3-CTD 結構和功能提供依據(jù)。晶學研究
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

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本文編號：2516890