發(fā)布時間：2019-07-18 07:23

【摘要】：牛支原體(Mycoplasma bovis,M.bovis)是感染牛的一種致病性病原體,主要引起牛乳腺炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎、中耳炎,也可引起角膜炎、結(jié)膜炎等疾病,給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2008年,我國首次報道了M.bovis引起的犢牛傳染性肺炎,并造成了很大損失。目前,牛支原體感染已成為危害我國養(yǎng)牛業(yè)的重要疾病之一。但我國迄今尚無特異、敏感的M.bovis抗體檢測試劑,缺乏有效的流行病學(xué)技術(shù)手段,這給牛支原體病的預(yù)防控制帶來了困難。本研究利用牛支原體P48重組蛋白,建立了檢測M.bovis抗體的間接血凝試驗方法和膠體金免疫層析試紙條,并完成了試劑盒組裝、實驗室試制和質(zhì)量研究,為牛支原體病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效工具,對本病的預(yù)防控制具有重要意義。本研究第一部分為M.bovis抗體的間接血凝試驗方法和膠體金免疫層析試紙條檢測方法的建立。在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,優(yōu)化并合成牛支原體的p48基因,克隆到p ET32a(+)表達(dá)載體上后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),16℃低溫長時間誘導(dǎo),獲得部分可溶性表達(dá)的P48重組蛋白。經(jīng)Western-blot檢測,純化的P48重組蛋白能與M.bovis高免血清發(fā)生特異性反應(yīng),具有良好的反應(yīng)原性。以純化的P48重組蛋白致敏醛化-鞣酸化的綿羊紅細(xì)胞,建立了檢測牛支原體抗體的間接血凝試驗方法(IHA)。P48重組蛋白致敏紅細(xì)胞的最佳濃度是20~40μg/m L,M.bovis高免血清抗體效價達(dá)1:211。該方法對牛肺疫、牛巴氏桿菌病、牛病毒性腹瀉病、布氏桿菌病、結(jié)核病、口蹄疫、牛生殖道支原體感染、里奇氏支原體感染、大腸桿菌病陽性血清檢測均為陰性。分析特異性為100%,分析敏感性為93.33%。與國外商品化的ELISA試劑盒比較,平均符合率為96.15%。對833份田間血清和1084份乳清進(jìn)行檢測,陽性率分別是15.37%和19.56%。結(jié)果表明,該方法敏感性高、特異性強和重復(fù)性好,可用于牛支原體抗體水平檢測、牛支原體病的輔助診斷和流行病學(xué)調(diào)查。利用合適粒徑的膠體金顆粒在p H7.4條件下標(biāo)記6μg/m L P48重組蛋白作為金標(biāo)抗原包被金標(biāo)墊、山羊抗牛Ig G(H+L)二抗包被檢測線(T線)、兔抗P48重組蛋白Ig G多抗包被質(zhì)控線(C線),組裝成膠體金免疫層析試紙條(ICS)。該試紙條檢測M.bovis高免血清,效價可至1:106。檢測上述相近病原或者類癥病原陽性血清,不發(fā)生交叉反應(yīng)。與IHA方法相比,陽性符合率為93.57%,陰性符合率為93.02%,平均符合率為96.53%。檢測臨床血清200份,乳清108份,陽性率分別是21.50%、17.59%。結(jié)果表明該試紙條敏感、特異、快速,適合于牛支原體抗體的快速檢測。本研究第二部分依據(jù)農(nóng)業(yè)部683號公告對兩種方法進(jìn)行實驗室試制和質(zhì)量研究。建立了生產(chǎn)試劑盒用的種子批,規(guī)范了陰、陽性對照血清的制備和檢驗方法,并試制了兩種試劑各3批。對3批試劑分別進(jìn)行了敏感性、特異性、重復(fù)性和保存期試驗,結(jié)果實驗室試制的兩種試劑質(zhì)量穩(wěn)定,檢測結(jié)果可靠,為下一步申報新獸藥證書積累了實驗數(shù)據(jù)。
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 圖 4.3 膠體金免疫層析試紙條特異性試驗檢測Fig.4.3 Specificity detection of colloidal gold immunoassay test strip2 分別為牛支原體陽性血清、健康牛血清即陰性對照、空白對照、牛肺疫陽性血清、牛巴氏桿菌病陽性血清、牛病毒性腹瀉病陽性、布氏桿菌病陽性血清、結(jié)核病陽性血清、口蹄疫陽性血清、里奇氏支原體感染陽性血清、牛生殖道支原體感染陽性血清、大腸桿菌病陽性血清）.5 敏感性試驗將牛支原體高免血清稀釋成不同滴度 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，同時設(shè)立健康清的陰性對照，以及樣品稀釋液作為空白對照，試紙條檢測結(jié)果為：陰性對照、空白對照均，血清滴度從 10-1~10-6檢測結(jié)果均為陽性，血清滴度 10-7的檢測結(jié)果為陰性。
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 圖 4.3 膠體金免疫層析試紙條特異性試驗檢測Fig.4.3 Specificity detection of colloidal gold immunoassay test strip12 分別為牛支原體陽性血清、健康牛血清即陰性對照、空白對照、牛肺疫陽性血清、牛巴氏桿菌病陽性血清、牛病毒性腹瀉病、布氏桿菌病陽性血清、結(jié)核病陽性血清、口蹄疫陽性血清、里奇氏支原體感染陽性血清、牛生殖道支原體感染陽性血清、大菌病陽性血清）2.5 敏感性試驗將牛支原體高免血清稀釋成不同滴度 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，同時設(shè)立血清的陰性對照，，以及樣品稀釋液作為空白對照，試紙條檢測結(jié)果為：陰性對照、空白對立，血清滴度從 10-1~10-6檢測結(jié)果均為陽性，血清滴度 10-7的檢測結(jié)果為陰性。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.23

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 張付賢;王興龍;;免疫膠體金技術(shù)影響因素分析[J];中國畜牧獸醫(yī);2009年05期

2 許欣;王鋒;;免疫膠體金技術(shù)及其在臨床診斷上的研究進(jìn)展[J];江西農(nóng)業(yè)學(xué)報;2009年06期

3 李媛;董惠;張美晶;陳超;曹培麗;郭丹;姜海芳;辛九慶;;牛支原體套式PCR檢測方法的建立[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2009年09期

4 冉智光;謝建華;駱璐;楊澤林;凌洪權(quán);蘇承忠;熊仲良;范偉興;米自由;;我國部分地區(qū)牛支原體肺炎和關(guān)節(jié)炎的病原體診斷[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2010年01期

5 何軍;吳移謀;;支原體脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白的研究進(jìn)展[J];中國人獸共患病學(xué)報;2008年11期

6 吳金迪;李媛;白帆;汪洋;劉素麗;周玉梅;張秀英;辛九慶;;牛支原體表面一種新的膜蛋白(P33)的鑒定及特性研究[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2014年09期

本文編號：2515728