發(fā)布時間：2019-07-18 07:19

【摘要】：[目的]本試驗旨在研究4個種屬(豬、人、小鼠、牛)Mx蛋白抗水皰性口炎病毒(VSV)的活性,以揭示胞質(zhì)定位Mx蛋白抗VSV活性的保守性。[方法]設(shè)計特異性引物,PCR擴(kuò)增4個種屬Mx蛋白的全長基因,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒;PK-15細(xì)胞過表達(dá)重組質(zhì)粒,Western blot或間接免疫熒光試驗(IFA)檢測4個種屬Mx蛋白在PK-15細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及分布;過表達(dá)Mx蛋白的PK-15細(xì)胞感染VSV,8或16 h后收樣,分別用RT-q PCR、Western blot、IFA和噬斑減少試驗來分析VSV的復(fù)制。[結(jié)果]成功克隆并表達(dá)了4個種屬Mx蛋白的全長基因,且Mx蛋白大小正確;雖然豬Mx1蛋白和小鼠Mx2蛋白以棒狀形式分布于細(xì)胞質(zhì)中,而豬Mx2蛋白、人Mx A蛋白和牛Mx1蛋白以顆粒形式彌散分布于細(xì)胞質(zhì)中,但4個種屬Mx蛋白均能通過抑制VSV-G mRNA的轉(zhuǎn)錄、減少VSV-G蛋白的合成及降低子代病毒的滴度來顯著抑制VSV的增殖。[結(jié)論]4個種屬Mx蛋白都能顯著抑制VSV在PK-15細(xì)胞中的增殖。
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圖片說明： 第4期高志參，等:4個種屬Mx蛋白抑制水皰性口炎病毒的研究標(biāo)準(zhǔn)序列均成功切出2條大小正確的目的條帶。將酶切結(jié)果正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果與目的基因進(jìn)行序列比對，結(jié)果完全正確。這說明成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒:pcDNA3．0－poMx1、pcDNA3．0－poMx2、pcDNA3．0－HuMxA、pcDNA3．0－mmMx2、pcDNA3．0－boMx1。圖1PCＲ擴(kuò)增結(jié)果Fig.1ＲesultsofPCＲamplificationM．DNAmarker(DL5000);1．poMx1;2．poMx2;3．HuMxA;4．mmMx2;5．boMx1圖2重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.2DoubledigestionidentificationoftherecombinantplasmidsM．DNAmarker(DL5000);1．pcDNA3．0－poMx1;2．pcDNA3．0－poMx2;3．pcDNA3．0-HuMxA;4．pcDNA3．0－mmMx2;5．pcDNA3．0－boMx1;6．pcDNA3．0圖44個種屬Mx蛋白在PK-15細(xì)胞中表達(dá)分布的IFA觀察Fig.4IFAobservationofexpressionanddistributionofMxproteinsfromfourspeciesinPK-15cells圖34個種屬Mx蛋白在PK-15細(xì)胞中的表達(dá)分析Fig.3AnalysisofexpressionofMxproteinsfromfourspeciesinPK-15cellsCK:空白細(xì)胞對照Blankcontrol2．24個種屬Mx蛋白在PK-15細(xì)胞中的表達(dá)活性4個種屬Mx蛋白在PK-15細(xì)胞中過表達(dá)24h后進(jìn)行Westernblot分析，結(jié)果(圖3)顯示:在PK-15細(xì)胞中，4個種屬Mx蛋白均成功過表達(dá)，經(jīng)鑒定，poMx1、poMx2、HuMxA、mmMx2、boMx1的相對分子質(zhì)量分別為76×103、82×103、75．8×103、75×103、74．3×103。2．34個種屬Mx蛋白在PK-15細(xì)胞中的分布IFA結(jié)果(圖4)顯示:在PK-15細(xì)胞中，poMx1蛋白及mmMx2蛋白均以棒狀形式分布于細(xì)胞質(zhì)中;poMx2、HuMxA及boMx1蛋白均以顆粒形式彌散分布于細(xì)胞質(zhì)中。2．44個種屬Mx蛋白的抗VSV活性分析2．4．1ＲT-qPCＲ分析結(jié)果(圖5)顯示:在感?
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圖片說明： 第4期高志參，等:4個種屬Mx蛋白抑制水皰性口炎病毒的研究標(biāo)準(zhǔn)序列均成功切出2條大小正確的目的條帶。將酶切結(jié)果正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果與目的基因進(jìn)行序列比對，結(jié)果完全正確。這說明成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒:pcDNA3．0－poMx1、pcDNA3．0－poMx2、pcDNA3．0－HuMxA、pcDNA3．0－mmMx2、pcDNA3．0－boMx1。圖1PCＲ擴(kuò)增結(jié)果Fig.1ＲesultsofPCＲamplificationM．DNAmarker(DL5000);1．poMx1;2．poMx2;3．HuMxA;4．mmMx2;5．boMx1圖2重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.2DoubledigestionidentificationoftherecombinantplasmidsM．DNAmarker(DL5000);1．pcDNA3．0－poMx1;2．pcDNA3．0－poMx2;3．pcDNA3．0-HuMxA;4．pcDNA3．0－mmMx2;5．pcDNA3．0－boMx1;6．pcDNA3．0圖44個種屬Mx蛋白在PK-15細(xì)胞中表達(dá)分布的IFA觀察Fig.4IFAobservationofexpressionanddistributionofMxproteinsfromfourspeciesinPK-15cells圖34個種屬Mx蛋白在PK-15細(xì)胞中的表達(dá)分析Fig.3AnalysisofexpressionofMxproteinsfromfourspeciesinPK-15cellsCK:空白細(xì)胞對照Blankcontrol2．24個種屬Mx蛋白在PK-15細(xì)胞中的表達(dá)活性4個種屬Mx蛋白在PK-15細(xì)胞中過表達(dá)24h后進(jìn)行Westernblot分析，結(jié)果(圖3)顯示:在PK-15細(xì)胞中，，4個種屬Mx蛋白均成功過表達(dá)，經(jīng)鑒定，poMx1、poMx2、HuMxA、mmMx2、boMx1的相對分子質(zhì)量分別為76×103、82×103、75．8×103、75×103、74．3×103。2．34個種屬Mx蛋白在PK-15細(xì)胞中的分布IFA結(jié)果(圖4)顯示:在PK-15細(xì)胞中，poMx1蛋白及mmMx2蛋白均以棒狀形式分布于細(xì)胞質(zhì)中;poMx2、HuMxA及boMx1蛋白均以顆粒形式彌散分布于細(xì)胞質(zhì)中。2．44個種屬Mx蛋白的抗VSV活性分析2．4．1ＲT-qPCＲ分析結(jié)果(圖5)顯示:在感?
【作者單位】： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院;
【基金】：國家自然科學(xué)基金項目(31572554)
【分類號】：S852.65

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本文編號：2515727