發(fā)布時間：2018-03-10 13:32

  本文選題：豬繁殖與呼吸綜合征病毒　切入點：RNA測序　出處：《中國農業(yè)大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS Virus, PRRSV)引起的豬傳染疾病。該病已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的疾病之一。近來研究表明,不同豬品種感染PRRSV后表現出的臨床癥狀的嚴重程度有明顯差異。然而,豬遺傳變異對PRRSV耐受性的作用分子機理尚不清楚�；�于合作單位華中農業(yè)大學對不同豬種感染PRRSV后臨床癥狀比較分析,本論文選取了對PRRSV耐受性較強的通城豬和耐受性較差的長白豬作為研究材料,采用高通量測序的方法,對感染PRRSV后第3、5和7天豬和對照組豬的肺組織,進行mRNA-seq和miRNA測序,從編碼基因和非編碼RNA兩個方面研究通城豬和長白豬對PRRSV耐受性差異的分子機理。為了研究通城豬和長白豬在感染PRRSV后基因表達調控的差異,本文將感染PRRSV后第3、第5和第7天的豬肺組織基因表達量分別和對照組進行比較,鑒定得到通城豬在各時間點差異基因數為:244、652、764,合并得到1288個差異顯著表達基因,少于長白豬合并后差異顯著基因個數2746個(2035、2037、843)的一半。這1288和2746個差異顯著表達基因中只有913個基因是重疊的,這表明,PRRSV感染導致兩種豬對基因的表達調控有明顯差異。進一步研究發(fā)現,感染組與對照組相比,通城豬基因的表達變化幅度明顯小于長白豬。根據以上結果,本文挑選出了在兩個品種豬之間存在表達模式差異的6個候選基因:BID、BTG2、MX1、BCL-XL、IFIT1和SOD1。在Marc-145細胞中過表達這6個基因,均能顯著抑制PRRSV在Marc-145細胞中的復制。與豬的參考基因組比較,本文在通城豬和長白豬中分別鑒定得到了 98416和34994個SNPs,發(fā)現了兩個位于BTG2和BID基因的3'UTR的miRNA保守結合位點序列上的通城豬具有,而長白豬沒有的SNPs。雙熒光素酶活性檢測表明,與長白豬基因型相比,這兩個SNPs均能顯著影響雙熒光素酶活性。通城豬和長白豬在感染PRRSV后對BTG2和BID基因表達調控的差異,可能是與位于BTG2和BID基因的3'UTR的SNPs有關的。本文也利用此數據對兩種豬與PRRSV感染相關的lncRNA (4024個)的表達進行了分析。感染后第3天與對照組相比,本文鑒定得到了 305個在兩種豬中有相反表達模式的lncRNAs。同時,本論文發(fā)現了與人類中參與HIV感染過程的NEAT1-lncRNA序列相似的NEAT1-like在兩個豬品種中感染PRRSV后第3天的表達量均大幅度上調,表明豬NEAT1-like可能參與了PRRSV感染過程。此外,本文還對兩種豬PRRSV感染組和對照組的miRNA表達譜進行了比較分析,并得到了以下結果:1、兩種豬中共檢測到278個已知和294個新的miRNA表達;2、將通城豬感染PRRSV后的第3、5和7天豬肺組織的miRNA表達量與對照組進行比較,得到了 52、62、72個差異顯著表達miRNA;將長白豬感染PRRSV后的第3、5和7天肺組織的miRNA表達量與對照組相比,得到了 72、75、109個差異顯著表達miRNA; 3、與對照組相比,qRT-PCR驗證了六個miRNA的差異顯著表達,其結果與測序數據分析結果一致;4、本文通過預測發(fā)現,miR-2320-5p可能直接與PRRSV基因組3'UTR保守序列結合;5、與對照組相比,PRRSV感染會導致兩種豬的miRNA編輯水平均顯著上升。綜上所述,本文鑒定得到了與PRRSV感染相關的編碼基因(BID、BTG2、MX1、BCL-XL、IFI71和SOD1)、lncRNAs和miRNAs、可能與豬對PRRSV耐受性有關的SNPs。此項研究為篩選得到新的抗PRRSV基因提供了新的思路;為進一步探明遺傳變異對不同豬種感染PRRSV表現出的不同耐受性提供了科學依據;同時也為闡明非編碼序列(lncRNA和miRNA)參與PRRSV感染的機制和抗病育種提供了重要的科學理論基礎。
[Abstract]:Porcine reproductive and respiratory syndrome (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) is composed of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRS Virus, PRRSV) of infectious diseases caused by swine. The disease has become one of the most serious diseases of swine. Recent research shows that there are significant differences in different pig breeds after PRRSV infection the clinical severity of symptoms. However, the molecular mechanism of porcine genetic variation in PRRSV tolerance is not clear. The cooperation unit of Huazhong Agricultural University in different pig breeds comparative analysis of clinical symptoms of PRRSV infection based on the select of PRRSV strong tolerance of Tongcheng pigs and less tolerance of Landrace as the study material. By using the method of high-throughput sequencing, the infection of PRRSV 3,5 after 7 days and pigs and pigs in the control group lung tissue, mRNA-seq and miRNA sequencing, from the two aspects of gene encoding and RNA encoding Study on Tongcheng and Landrace pigs PRRSV molecules on the difference of tolerance mechanism. In order to study the difference of gene expression regulation of Tongcheng and Landrace pigs at PRRSV after infection, the infection of PRRSV after third, respectively, compared with the control group lung tissue gene fifth and seventh days of expression, the number of genes identified at each time point between Tongcheng pig: 244652764, 1288 differentially expressed genes were significantly less than the merger, after the merger of significant differences between Landrace gene number 2746 (20352037843) of the half. The 1288 and 2746 significant differences in gene expression of only 913 genes overlap, suggesting that PRRSV infection leads to the regulation of the expression of the gene was two pigs differences. Further studies showed that the infection group compared with the control group, the expression changes of Tongcheng gene was significantly less than that of Landrace. According to the above results, this paper selected two varieties There are 6 candidate gene expression pattern differences between pigs: BID, BTG2, MX1, BCL-XL, IFIT1 and SOD1. in Marc-145 cells expressing the 6 genes could significantly inhibit the PRRSV replication in Marc-145 cells. Compared with the reference in the pig genome, Tongcheng pigs and Landrace pigs were identified 98416 and 34994 SNPs, found two in the BTG2 and BID genes of 3'UTR conserved miRNA binding site sequence of Tongcheng and Landrace has indicated that no SNPs. dual luciferase activity compared with Landrace genotypes, the two SNPs was significantly affected by dual luciferase activity. The expression of Tongcheng and Landrace pigs regulation of the differences of BTG2 and BID gene in PRRSV infection, and may be located in the BTG2 and BID gene of 3'UTR SNPs. This paper also use this data to lncRNA two pigs infected with PRRSV (4024) surface Was analyzed. Compared with the control group third days after infection, we identified 305 in two pigs have opposed the expression pattern of lncRNAs. at the same time, this paper found the expression similar to the NEAT1-lncRNA sequence of HIV infection in the process involved in human NEAT1-like in two pig breeds in third days after PRRSV staining are a big increase, indicate that porcine NEAT1-like may be involved in the process of PRRSV infection. In addition, the expression of the two pigs PRRSV infection group and control group of miRNA spectrum are analyzed, and the results are as follows: 1, two pigs were detected in 278 known and 294 new miRNA expression; 2, the Tongcheng pigs infected by PRRSV after 3,5 and 7 days of lung tissue miRNA expression were compared with control group, the 52,62,72 expression of miRNA was significantly different; the Landrace after infection with PRRSV at 3,5 and 7 days of lung tissue miRNA expression and Compared with the control group, the expression of miRNA 72,75109 significantly; 3, compared with the control group, qRT-PCR show the difference between the six miRNA significant expression, and the results of sequencing data analysis results are consistent; 4, this paper predicted that miR-2320-5p may be directly combined with the conserved sequences of PRRSV gene of group 3'UTR; 5, compared with the control group PRRSV infection leads to two swine miRNA editing level increased significantly. In summary, this paper identified encoding gene related with PRRSV infection (BID, BTG2, MX1, BCL-XL, IFI71 and SOD1), lncRNAs and miRNAs, and pigs to PRRSV tolerance related SNPs. this study screened for resistance a new PRRSV gene provides a new way of thinking; to provide a scientific basis for the different pigs infected with PRRSV showed different tolerance to further explore the genetic variation; also to clarify the non encoding sequence (lncRNA and miRNA) in PRR The mechanism of SV infection and the breeding of disease resistance provide an important scientific theoretical basis.

【學位授予單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

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