發(fā)布時(shí)間：2020-11-22 09:48

　　 血栓栓塞性疾病是當(dāng)前危害人類健康導(dǎo)致死亡的主要原因之一。防栓和溶栓是防治該病的關(guān)鍵。目前，國(guó)產(chǎn)正式應(yīng)用于臨床的溶栓藥暫限于人尿激酶(Urokinase,UK)，鏈激酶(Streptokinase,SK)，而尿激酶和鏈激酶的溶栓效率有限且因無纖維蛋白溶解特異性，易發(fā)生治療性出血。組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator,t-PA)是人血液中天然纖溶系統(tǒng)激活劑，與尿激酶和鏈激酶相比，人t-PA與血栓基質(zhì)有很高的特異性親和力。它能在血栓局部激活纖維蛋白原使其轉(zhuǎn)化成具有生物活性的纖維蛋白酶，后者可水解血栓的基質(zhì)——纖維蛋白，使凝血塊溶解，血管再通，并且不引起血纖溶系統(tǒng)性激活，因而大大降低了治療過程中出血的危險(xiǎn)，是一種用于治療急性心肌梗塞等血栓性疾病的特效藥物。t-PA除了參與體內(nèi)溶血和凝血的平衡調(diào)控外，還與其它一些重要的生理與病理過程密切相關(guān)，如組織再造、細(xì)胞遷移、排卵、補(bǔ)體激活、激肽產(chǎn)生，腫瘤侵襲等。 正常人體組織內(nèi)，t-PA分布廣，但含量非常低，如在血液中只有4-20μg/L。在人體內(nèi)半衰期短，僅4～5分鐘。因此從天然材料中很難大量制備t-PA，用于治療甚至研究。通過基因工程手段獲取大量t-PA是一條很有希望的途徑。生產(chǎn)重組蛋白的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。大腸桿菌缺乏修飾酶類，真核生物蛋白翻譯后無法進(jìn)行磷酸化、酰胺化等加工修飾，不能正確折疊，缺乏分泌作用形成無活性包含體。借助逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將目的基因?qū)�入�?xì)胞有潛在致癌性，并引起宿主病毒感染的可能。酵母提純工藝復(fù)雜、成本高，產(chǎn)品純度達(dá)不到要求。構(gòu)建高效表達(dá)載體以期得到高表達(dá)細(xì)胞株，是生產(chǎn)重組蛋白的有效方法。pcDNA3真核表達(dá)載體是構(gòu)建基因表達(dá)重組體的有效載體，可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)。SV40 鄭州大學(xué)2003屆研究生論文 組織型纖溶酶原激活劑(t一隊(duì))真核表達(dá)載體的構(gòu)建 啟動(dòng)子和CMv啟動(dòng)子都是強(qiáng)啟動(dòng)子，本實(shí)驗(yàn)將t一PAcDNA置于SV40和CMV 啟動(dòng)子調(diào)控之下，構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3一t一PA，為下一步研究轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 生產(chǎn)t~PA奠定了基礎(chǔ)。 材料和方法:以含t一PAcDNA的質(zhì)粒PETPFR為模板，設(shè)計(jì)上下游引物(引物 兩端分別帶Hindm和Sall酶切位點(diǎn))，PCR擴(kuò)增t一PA，用限制性內(nèi)切酶Hindm 和sall雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收2.Ikbt一PA酶切片段。PcDNA3用限制性 內(nèi)切酶Hindln和刀101雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收5.4kb酶切片段。Sall和 乃01的粘性末端互補(bǔ)。爪DNA hgase體外連接2.Ikb和5.4kb片段，16℃，過夜。 重組體轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM 109細(xì)菌。將轉(zhuǎn)化菌涂于含Amp的培養(yǎng)平皿，37℃溫箱培 養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑選10個(gè)克隆，接種于含Amp的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，小 提質(zhì)粒，酶切鑒定。限制性內(nèi)切酶Hindm單酶切，得到7.skb片段，Hindm和 Xbal雙酶切得到 5.4kb和2.Ikb片段，初步鑒定為陽性重組體。序列測(cè)定插入 片段正確。重組pcDAN3一t一PA真核表達(dá)載體與脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑 L幣。fectamineTMZooo混合轉(zhuǎn)染乳腺癌(McF一7)細(xì)胞，G418篩選陽性細(xì)胞，獲得 了MCF一7陽性細(xì)胞系。 結(jié)果: 1.陽性重組質(zhì)粒Hindm單酶切，瓊脂糖凝膠電泳顯示為7.skb條帶，Hindm和 Xbal雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳顯示為5.4kb和2.Ikb條帶。 2.插入片段序列測(cè)定正確，真核表達(dá)載體PcDNA3一t一PA構(gòu)建成功。 3.脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑LIPofectamin矛M2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染McF一7細(xì)胞，G418篩選，獲得 了MCF一7陽性細(xì)胞系。 結(jié)論: 1.本實(shí)驗(yàn)將t一PAcDNA置于SV40和CMv強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控之下，成功構(gòu)建了真核 表達(dá)載體peDNA3一t一PA，為下一步研究轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)t一PA奠定了基礎(chǔ)。 2.建立了表達(dá)組織纖溶酶原激活劑任PA)的MCF一7陽性細(xì)胞系。 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的組織型纖溶酶原激活劑(t一PA)真核表達(dá)載體為在哺乳動(dòng)物細(xì) 胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ)，成為生產(chǎn)高效溶栓藥t一PA的有效方法。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R346
【文章目錄】：
論文部分 組織型溶酶原激活劑（t-PA）真核表達(dá)載體的構(gòu)建
    中文摘要
    英文摘要
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    附圖
    討論
    小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
綜述部分 組織型纖溶酶原激活劑研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
英文縮寫詞
致謝

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 楊肅文,管茶英;用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血漿組織纖溶酶原激活物[J];上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志;2001年05期

2 楊鵬生,陳永久,董少紅,莊義浩,羅林杰,麥愛歡,陳科奇,林鐘文,吳盛標(biāo);重組組織型纖溶酶原激活劑加補(bǔ)救性冠狀動(dòng)脈介入術(shù)與直接冠狀動(dòng)脈介入術(shù)對(duì)急性心肌梗死的療效研究[J];中華心血管病雜志;2002年10期

本文編號(hào)：2894510