發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 10:48

　　 抗原特異性T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的有效產(chǎn)生及維持需要兩種信號(hào)――MHC-肽復(fù)合物提供的特異性抗原信號(hào)，以及由APC表面共刺激分子提供的共刺激信號(hào)(Costimulatory signal)，缺乏共刺激信號(hào)的抗原信號(hào)往往引起免疫耐受。CD28/CTLA-4－B7.1/B7.2共刺激途徑是最早深入研究的共刺激途徑之一，來(lái)自該途徑的共刺激信號(hào)對(duì)T細(xì)胞的活化和耐受發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。但眾多證據(jù)表明CD28并不是唯一的共刺激分子，例如CD28缺失的小鼠仍能產(chǎn)生一定的免疫應(yīng)答[1-4]。同時(shí)也有研究表明： T細(xì)胞免疫應(yīng)答后期，來(lái)自CD28的共刺激信號(hào)對(duì)活化后的T細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)并非必不可少，甚至不能稱為主要的信號(hào)[5-7]。 隨著基因組計(jì)劃的完成，多種具有共刺激效應(yīng)的T細(xì)胞表面受體被發(fā)現(xiàn)，有關(guān)T細(xì)胞活化共刺激信號(hào)的研究取得了許多新進(jìn)展。這些研究成果明確了B7-1/B7-2—CD28/CTLA-4和 CD40L-CD40共刺激信號(hào)通路在激發(fā)初始T細(xì)胞活化中占主導(dǎo)地位，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，大部分效應(yīng)性CD8+和CD4+T細(xì)胞的功能的發(fā)揮和維持，以及記憶性T細(xì)胞發(fā)生再次應(yīng)答并不依賴這兩條共刺激信號(hào)通路，提示在T細(xì)胞應(yīng)答的不同時(shí)空階段，不同的共刺激信號(hào)對(duì)T細(xì)胞的功能和效應(yīng)發(fā)揮著各自不同的調(diào)節(jié)作用[6.7]。在初始T細(xì)胞的活化階段，CD28、CD40L的共刺激信號(hào)發(fā)揮重要作用，而在記憶和效應(yīng)T細(xì)胞的功能發(fā)揮和維持階段可能還存在其他的免疫分子的參與[8,9]。 最近，ICOS-B7RP-1信號(hào)通路在參與調(diào)節(jié)記憶性和效應(yīng)性T細(xì)胞功能、維持外周耐受等方面的功能引起我們極大的關(guān)注。ICOS(Inducible COStimulator，誘導(dǎo)共刺激分子)是CD28家族中繼發(fā)現(xiàn)CD28、CTLA-4之后的第3個(gè)成員。ICOS需要TCR信號(hào)的誘導(dǎo)，局限表達(dá)于活化后的T細(xì)胞膜上，故命名為誘導(dǎo)共刺激分子[10,11]。其配體ICOSL(B7RP-1，B7H2)是B7家族成員，主要在B細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)[12]。目前認(rèn)為ICOS作用于免疫應(yīng)答的效應(yīng)和記憶階段，對(duì)已經(jīng)受到抗原刺激的免疫細(xì)胞擴(kuò)增、遷移釋放效應(yīng)性細(xì)胞因子都具有重要的影響[13,14]。此外，ICOS途徑還能上調(diào)T細(xì)胞表面多種趨化因子受體的表達(dá)，并且能促進(jìn)CD40L的表達(dá)，間接增強(qiáng)CD40-CD40L途徑的免疫活化效應(yīng)[15-17]。這些發(fā)現(xiàn)提示，效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞的功能發(fā)揮和維持依賴于ICOS的共刺激信號(hào)。此外，多種疾病的動(dòng)物模型研究表明，以ICOS途徑為靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)對(duì)自身免疫性疾病和移植免疫的長(zhǎng)期耐受形成均有著重要的臨床治療 WP=11 意義[18,19]。 由于ICOS誘導(dǎo)表達(dá)于活化后T細(xì)胞上，并且在效應(yīng)性和記憶性T細(xì)胞功能的發(fā)揮和維持上起著重要作用，因此，干預(yù)ICOS共刺激途徑，可能有助于調(diào)節(jié)主要由活化后T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，如移植免疫中慢性排斥反應(yīng)、I型糖尿病等�；�于上述考慮，我們?cè)噲D通過單獨(dú)阻斷ICOS共刺激途徑或聯(lián)合干預(yù)其他相關(guān)途徑來(lái)研究ICOS對(duì)活化后的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的抑制作用，在本研究中，圍繞制備ICOS共刺激信號(hào)的阻斷劑――可溶性融合蛋白分子ICOSIg，主要進(jìn)行了以下幾部分的工作： 1. 人ICOSIg真核表達(dá)載體的構(gòu)建 ⑴人ICOS全長(zhǎng)cDNA的克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建：采用PCR技術(shù)，從cDNA文庫(kù)phAD.CAD擴(kuò)增出人ICOS全長(zhǎng)的cDNA序列，定向克隆入真核表達(dá)載體pCI-neo中，酶切測(cè)序鑒定，為從細(xì)胞水平研究ICOS的功能奠定了基礎(chǔ)。 ⑵人ICOSIg真核表達(dá)載體的構(gòu)建：利用基因工程技術(shù)將ICOS膜外區(qū)與hIgG1Fc一起裝入真核表達(dá)載體pcDNA3中，酶切測(cè)序鑒定，證實(shí)得到了ICOS的可溶性表達(dá)重組載體。 2. 人ICOSIg融合蛋白的表達(dá)，純化和鑒定。 ⑴脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS-7；夾心ELISA法證實(shí)培養(yǎng)上清中有融合蛋白的表達(dá)。 ⑵蛋白A親和層析法純化融合蛋白ICOSIg，用SDS-PAGE、夾心ELISA、Western Blot鑒定融合蛋白的表達(dá)。 ⑶利用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)證實(shí)ICOSIg在體外具有抑制T細(xì)胞增殖、降低IL-10分泌功能，表明ICOSIg具有阻斷ICOS途徑的生物活性。為進(jìn)一步的功能研究或應(yīng)用打下基礎(chǔ)。 3. ICOSIg的蛋白質(zhì)分子特性和結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的生物信息學(xué)分析 ⑴利用生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)CD28家族各成員膜外區(qū)和IgV結(jié)構(gòu)域序列，分析ICOSIg的蛋白質(zhì)分子特性。 ⑵在此基礎(chǔ)上，通過同源模建手段，獲得了ICOS和ICOSIg的三維空間結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)FDPPPF和TKGSGN基序可能是ICOSIg的功能位點(diǎn)，后者未見報(bào)道。為改造ICOS的結(jié)構(gòu)功能，獲得新的ICOS突變體提供線索。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

體積 99μl↓℃ 2min，暫停，加入 Taq DNA 聚合酶 1μl( 5U)↓Touchdown PCR℃ 30sec，65℃→50℃ 30sec，72℃ l min； 15 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降 1后退火溫度從 65℃降到 50℃�！� 30sec，55℃ 30sec，72℃ l min； 30 個(gè)循環(huán)↓ 10min 4μl PCR 產(chǎn)物于 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。、人 ICOS 真核表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建策略

第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文篩選、鑒定板上的若干單個(gè)菌落，接種于 5m200rpm 振搖培養(yǎng)過夜，以 OmegaⅠ、SalⅠ酶切鑒定，初步判定陽(yáng)性接，系定向克隆，無(wú)需鑒定陽(yáng)性重實(shí)驗(yàn)結(jié)果DNA 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定：期相符，特異性高，未見明顯的引1 2 3

圖 1-2 人 ICOS-pCI-neo 的酶切鑒定fication of recombinated hICOS-pCI-neo plaCI-neo 的序列測(cè)定結(jié)果( 見圖 1-P-036224)比對(duì)，開放閱讀框完整公布序列相同。表明我們已經(jīng)將人載體上，為下一步工作打下基礎(chǔ)
【共引文獻(xiàn)】

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