發(fā)布時間：2020-11-21 10:48

　　 抗原特異性T淋巴細胞免疫應答的有效產(chǎn)生及維持需要兩種信號――MHC-肽復合物提供的特異性抗原信號，以及由APC表面共刺激分子提供的共刺激信號(Costimulatory signal)，缺乏共刺激信號的抗原信號往往引起免疫耐受。CD28/CTLA-4－B7.1/B7.2共刺激途徑是最早深入研究的共刺激途徑之一，來自該途徑的共刺激信號對T細胞的活化和耐受發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。但眾多證據(jù)表明CD28并不是唯一的共刺激分子，例如CD28缺失的小鼠仍能產(chǎn)生一定的免疫應答[1-4]。同時也有研究表明： T細胞免疫應答后期，來自CD28的共刺激信號對活化后的T細胞發(fā)揮效應并非必不可少，甚至不能稱為主要的信號[5-7]。 隨著基因組計劃的完成，多種具有共刺激效應的T細胞表面受體被發(fā)現(xiàn)，有關T細胞活化共刺激信號的研究取得了許多新進展。這些研究成果明確了B7-1/B7-2—CD28/CTLA-4和 CD40L-CD40共刺激信號通路在激發(fā)初始T細胞活化中占主導地位，同時也發(fā)現(xiàn)，大部分效應性CD8+和CD4+T細胞的功能的發(fā)揮和維持，以及記憶性T細胞發(fā)生再次應答并不依賴這兩條共刺激信號通路，提示在T細胞應答的不同時空階段，不同的共刺激信號對T細胞的功能和效應發(fā)揮著各自不同的調(diào)節(jié)作用[6.7]。在初始T細胞的活化階段，CD28、CD40L的共刺激信號發(fā)揮重要作用，而在記憶和效應T細胞的功能發(fā)揮和維持階段可能還存在其他的免疫分子的參與[8,9]。 最近，ICOS-B7RP-1信號通路在參與調(diào)節(jié)記憶性和效應性T細胞功能、維持外周耐受等方面的功能引起我們極大的關注。ICOS(Inducible COStimulator，誘導共刺激分子)是CD28家族中繼發(fā)現(xiàn)CD28、CTLA-4之后的第3個成員。ICOS需要TCR信號的誘導，局限表達于活化后的T細胞膜上，故命名為誘導共刺激分子[10,11]。其配體ICOSL(B7RP-1，B7H2)是B7家族成員，主要在B細胞和單核細胞表達[12]。目前認為ICOS作用于免疫應答的效應和記憶階段，對已經(jīng)受到抗原刺激的免疫細胞擴增、遷移釋放效應性細胞因子都具有重要的影響[13,14]。此外，ICOS途徑還能上調(diào)T細胞表面多種趨化因子受體的表達，并且能促進CD40L的表達，間接增強CD40-CD40L途徑的免疫活化效應[15-17]。這些發(fā)現(xiàn)提示，效應T細胞和記憶T細胞的功能發(fā)揮和維持依賴于ICOS的共刺激信號。此外，多種疾病的動物模型研究表明，以ICOS途徑為靶點的免疫調(diào)節(jié)對自身免疫性疾病和移植免疫的長期耐受形成均有著重要的臨床治療 WP=11 意義[18,19]。 由于ICOS誘導表達于活化后T細胞上，并且在效應性和記憶性T細胞功能的發(fā)揮和維持上起著重要作用，因此，干預ICOS共刺激途徑，可能有助于調(diào)節(jié)主要由活化后T細胞介導的免疫應答，如移植免疫中慢性排斥反應、I型糖尿病等�；�于上述考慮，我們試圖通過單獨阻斷ICOS共刺激途徑或聯(lián)合干預其他相關途徑來研究ICOS對活化后的T細胞介導的免疫應答的抑制作用，在本研究中，圍繞制備ICOS共刺激信號的阻斷劑――可溶性融合蛋白分子ICOSIg，主要進行了以下幾部分的工作： 1. 人ICOSIg真核表達載體的構建 ⑴人ICOS全長cDNA的克隆及其真核表達載體的構建：采用PCR技術，從cDNA文庫phAD.CAD擴增出人ICOS全長的cDNA序列，定向克隆入真核表達載體pCI-neo中，酶切測序鑒定，為從細胞水平研究ICOS的功能奠定了基礎。 ⑵人ICOSIg真核表達載體的構建：利用基因工程技術將ICOS膜外區(qū)與hIgG1Fc一起裝入真核表達載體pcDNA3中，酶切測序鑒定，證實得到了ICOS的可溶性表達重組載體。 2. 人ICOSIg融合蛋白的表達，純化和鑒定。 ⑴脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS-7；夾心ELISA法證實培養(yǎng)上清中有融合蛋白的表達。 ⑵蛋白A親和層析法純化融合蛋白ICOSIg，用SDS-PAGE、夾心ELISA、Western Blot鑒定融合蛋白的表達。 ⑶利用混合淋巴細胞反應證實ICOSIg在體外具有抑制T細胞增殖、降低IL-10分泌功能，表明ICOSIg具有阻斷ICOS途徑的生物活性。為進一步的功能研究或應用打下基礎。 3. ICOSIg的蛋白質(zhì)分子特性和結構功能關系的生物信息學分析 ⑴利用生物信息學手段預測CD28家族各成員膜外區(qū)和IgV結構域序列，分析ICOSIg的蛋白質(zhì)分子特性。 ⑵在此基礎上，通過同源模建手段，獲得了ICOS和ICOSIg的三維空間結構，發(fā)現(xiàn)FDPPPF和TKGSGN基序可能是ICOSIg的功能位點，后者未見報道。為改造ICOS的結構功能，獲得新的ICOS突變體提供線索。
【學位單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2003
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

體積 99μl↓℃ 2min，暫停，加入 Taq DNA 聚合酶 1μl( 5U)↓Touchdown PCR℃ 30sec，65℃→50℃ 30sec，72℃ l min； 15 個循環(huán)，每個循環(huán)降 1后退火溫度從 65℃降到 50℃�！� 30sec，55℃ 30sec，72℃ l min； 30 個循環(huán)↓ 10min 4μl PCR 產(chǎn)物于 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。、人 ICOS 真核表達載體的構建構建策略

第三軍醫(yī)大學碩士學位論文篩選、鑒定板上的若干單個菌落，接種于 5m200rpm 振搖培養(yǎng)過夜，以 OmegaⅠ、SalⅠ酶切鑒定，初步判定陽性接，系定向克隆，無需鑒定陽性重實驗結果DNA 的 PCR 擴增產(chǎn)物電泳鑒定：期相符，特異性高，未見明顯的引1 2 3

圖 1-2 人 ICOS-pCI-neo 的酶切鑒定fication of recombinated hICOS-pCI-neo plaCI-neo 的序列測定結果( 見圖 1-P-036224)比對，開放閱讀框完整公布序列相同。表明我們已經(jīng)將人載體上，為下一步工作打下基礎
【共引文獻】

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本文編號：2892897