發(fā)布時(shí)間：2020-11-15 09:13

　　 【背景】目前食品中甲肝病毒分子的檢測(cè)缺乏安全、穩(wěn)定的RNA標(biāo)準(zhǔn)參考樣品,影響了檢測(cè)結(jié)果的科學(xué)性與準(zhǔn)確性�！灸康摹炕�于Qβ噬菌體裝甲R(shí)NA技術(shù)構(gòu)建內(nèi)含甲肝病毒檢測(cè)靶標(biāo)的裝甲R(shí)NA (Hepatitis A virus armored RNA,AR-HAV),并開展初步定值、均勻性、穩(wěn)定性研究,為HAV分子檢測(cè)提供標(biāo)準(zhǔn)參考樣品�！痉椒ā咳斯ず铣砂�含Qβ噬菌體成熟酶編碼基因、衣殼蛋白編碼基因、包裝位點(diǎn)、HAV檢測(cè)靶標(biāo)cDNA序列的核酸片段QGBHAV,并亞克隆到pET-28a(+)中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-QGBHAV,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行原核表達(dá),利用超速離心、丙烯葡聚糖凝膠層析柱純化AR-HAV后電鏡觀察。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR對(duì)AR-HAV進(jìn)行初步定值及均勻性和穩(wěn)定性研究�！窘Y(jié)果】SDS-PAGE結(jié)果表明重組質(zhì)粒在大腸桿菌中有約14.1 kD的目的蛋白表達(dá);純化后的AR-HAV無(wú)雜蛋白和殘留質(zhì)粒;電鏡下可見結(jié)構(gòu)完整、大小約為25nm的病毒樣顆粒;定值結(jié)果顯示,AR-HAV中檢測(cè)靶標(biāo)RNA的含量為(2.57±0.12)×107 copies/μL;均勻性分析結(jié)果為F=1.23F0.05 (9,20),證實(shí)AR-HAV的均勻性良好;穩(wěn)定性結(jié)果表明,AR-HAV在可37°C保存9 d,25°C保存25 d,4°C保存40 d,-20°C保存180 d,-80°C至少保存360 d�！窘Y(jié)論】基于Qβ噬菌體制備的AR-HAV拷貝數(shù)高,具有良好的均勻性和穩(wěn)定性,可為HAV的分子檢測(cè)提供安全、穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)參考樣品。
【部分圖文】：

?罰??1.7.1方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，每管重復(fù)3次，單因素方差和線性回歸方法統(tǒng)計(jì)樣本的穩(wěn)定性程度。2結(jié)果與分析2.1pET-QGBHAV重組質(zhì)粒鑒定酶切鑒定重組質(zhì)粒(圖1)幵測(cè)序，結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pET-QGBHAV。2.2pET-QGBHAV的誘導(dǎo)表達(dá)及純化pET-QGBHAV在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在大約14.1kD處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，如圖2所示，與預(yù)期結(jié)果一致。超聲破碎后的上清液經(jīng)過(guò)超離、透析、濾膜過(guò)濾、丙烯葡聚糖凝膠層析圖1pET-QGBHAV的酶切鑒定圖Figure1EnzymedigestionofpET-QGBHAVNote:M:DL15000DNAmarker;1:NotI/BamHI;2:NotI.

姚琳等:基于Qβ噬菌體的甲肝病毒裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)參考樣品的研制213Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn柱純化后得到AR-HAV，其SDS-PAGE分析結(jié)果表明未見其他雜條帶，純化效果良好，如圖3所示。2.3AR-HAV的電鏡觀察甴鏡觀察純化后的AR-HAV，可看到大量結(jié)構(gòu)完整、大小均一的病毒樣顆粒，直徑約25nm，與預(yù)期大小一致，結(jié)果如圖4所示。圖2pET-QGBHAV表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Figure2SDS-PAGEanalysisofpET-QGBHAVexpressproducts注：M：蛋白質(zhì)分子量；1：未誘導(dǎo)的pET-28a(+)空載體；2：誘導(dǎo)后的pET-28a(+)空載體；3：誘導(dǎo)前重組菌；46：誘導(dǎo)后重組菌.Note:M:Proteinladder;1:pET-28a(+)withoutinduction;2:InducedpET-28a(+);3:Expressproductstherecombinantbacteriawithoutinduction;46:Expressproductsfromtheinducedrecombinantbacteria.圖3AR-HAV純化后SDS-PAGE分析Figure3SDS-PAGEanalysisofAR-HAVafterpurification注：M：蛋白質(zhì)分子量；12：誘導(dǎo)表達(dá)菌液；3：層析純化AR-HAV.Note:M:Proteinladder;12:Inducedrecombinantbacteria;3:PurifiedAR-HAV.2.4AR-HAV中殘留質(zhì)粒檢測(cè)以AR-HAV為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示AR-HAV與陰性對(duì)照的Ct值接近，無(wú)明顯擴(kuò)增，說(shuō)明制備的AR-HAV中無(wú)質(zhì)粒DNA的殘留，結(jié)果如圖5所示。2.5AR-HAV的定值將制備的cRNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法根據(jù)稀釋梯度和Ct值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=3.3471x+40.682，R2=0.999。隨機(jī)選取15管AR-HAV，采用

25nm，與預(yù)期大小一致，結(jié)果如圖4所示。圖2pET-QGBHAV表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Figure2SDS-PAGEanalysisofpET-QGBHAVexpressproducts注：M：蛋白質(zhì)分子量；1：未誘導(dǎo)的pET-28a(+)空載體；2：誘導(dǎo)后的pET-28a(+)空載體；3：誘導(dǎo)前重組菌；46：誘導(dǎo)后重組菌.Note:M:Proteinladder;1:pET-28a(+)withoutinduction;2:InducedpET-28a(+);3:Expressproductstherecombinantbacteriawithoutinduction;46:Expressproductsfromtheinducedrecombinantbacteria.圖3AR-HAV純化后SDS-PAGE分析Figure3SDS-PAGEanalysisofAR-HAVafterpurification注：M：蛋白質(zhì)分子量；12：誘導(dǎo)表達(dá)菌液；3：層析純化AR-HAV.Note:M:Proteinladder;12:Inducedrecombinantbacteria;3:PurifiedAR-HAV.2.4AR-HAV中殘留質(zhì)粒檢測(cè)以AR-HAV為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示AR-HAV與陰性對(duì)照的Ct值接近，無(wú)明顯擴(kuò)增，說(shuō)明制備的AR-HAV中無(wú)質(zhì)粒DNA的殘留，結(jié)果如圖5所示。2.5AR-HAV的定值將制備的cRNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法根據(jù)稀釋梯度和Ct值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=3.3471x+40.682，R2=0.999。隨機(jī)選取15管AR-HAV，采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法測(cè)定Ct值，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得知AR-HAV拷貝數(shù)為2.57×107copies/μL。應(yīng)用A類不確定度評(píng)定方法進(jìn)行評(píng)定，所得AR-HAV的不確定度為0.12×107，因此本次制備的AR-HAV定值結(jié)果為(2.57±0.12)×107copies/μL。2.6AR-HAV的均勻性實(shí)驗(yàn)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果顯示：F=Msamong/Mswithin=1.2
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