為了分析驗(yàn)證phaA、phaB和phaC三個(gè)基因的生物學(xué)功能，本實(shí)驗(yàn)采用PCR技術(shù)，從合成PHA的pseudomanas sp．菌株的亞克隆基因組片段中，分離出phaA、phaB和phaC三個(gè)基因片段，定向克隆至原核表達(dá)載體pBV220上，構(gòu)建了三個(gè)原核生物表達(dá)載體pBV-A、pBV-B和pBV-C，通過對(duì)表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)蛋白產(chǎn)物的SDS-PAGE分析、生物活性與功能分析，確定了基因phaA、phaB和phaC的生物學(xué)功能。結(jié)果表明： 1．利用所提取的開放閱讀框架的序列設(shè)計(jì)三對(duì)引物，采用PCR技術(shù)，從合成PHA的亞克隆片段中分離出phaA、phaB和phaC三個(gè)基因片段，經(jīng)凝膠電泳分析表明，所克隆的三個(gè)基因分子量大小與推測的三個(gè)開放閱讀框架中基因片段大小一致。 2．將phaA、phaB和phaC片段雙酶切后，定向克隆至原核表達(dá)載體pBV220，構(gòu)建了三個(gè)原核表達(dá)載體pBV-A、pBV-B和pBV-C；經(jīng)酶切分析表明，所克隆的三個(gè)基因phaA、phaB和phaC置于表達(dá)載體的正確閱讀框架下。 3．利用溫度誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后2小時(shí)外源基因開始表達(dá)，所表達(dá)蛋白的量隨著時(shí)間的增加而增加，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為4小時(shí)后外源基因表達(dá)的增加量趨于平穩(wěn)，確定4小時(shí)為較為合適的誘導(dǎo)時(shí)間。 4．表達(dá)載體pBV-A、pBV-B和pBV-C經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)所表達(dá)的蛋白均為可溶性蛋白，沒有包涵體出現(xiàn)；蛋白經(jīng)SDS—PAGE分析表明，基因phaA表達(dá)的蛋白分子量為42kDa，與β—酮硫裂解酶分子量大小一致；基因phaB表達(dá)的蛋白分子量為26kDa，與乙酰乙酰CoA還原酶分子量大小一致；基因phaC表達(dá)的蛋白分子量為63kDa，與PHA合成酶分子量大小一致。 5．將phaA、phaB和phaC基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物混和后，加入底物乙酰CoA，于230nm—240nm波長下，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在波長235nm處有明顯的PHA特異吸收峰；表明混和物中有PHA的產(chǎn)生，所表達(dá)的蛋白具有生物學(xué)活性和特定功能，證實(shí)所克隆的phaA、phaB和phaC就是合成PHA所需的三個(gè)基因。
【學(xué)位單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：Q785
【部分圖文】：

phaA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果因的PCR產(chǎn)物;M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量PCRamPlifieationofPhaAproduetofPhaA;M:PCRmarker，GC含量為65%，在PCR擴(kuò)增的過提高擴(kuò)增的特異性。PCR擴(kuò)增的循環(huán)的三個(gè)步驟為:94℃變性1分鐘，鐘，最后于4℃保溫。擴(kuò)增結(jié)果如析表明，所擴(kuò)增片段的分子量約7B分子量大小一致。

2phaA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果A基因的PCR產(chǎn)物;M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分2PCRamPlifieationofPhaA:PCRproduetofPhaA;M:PCRmarbp，GC含量為65%，在PCR擴(kuò)增數(shù)來提高擴(kuò)增的特異性。PCR擴(kuò)增循環(huán)的三個(gè)步驟為:94℃變性110分鐘，最后于4℃保溫。擴(kuò)增泳分析表明，所擴(kuò)增片段的分子phaB分子量大小一致。

.skb，GC含量為66%，AT與GC分，GC同時(shí)出現(xiàn)8~IObp以上而沒的變性與復(fù)性過程中所產(chǎn)生二級(jí)溫度(62℃)來調(diào)整目的基因擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的循環(huán)程序?yàn)?94℃95℃變性1分鐘，62℃復(fù)性1分鐘溫。擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示:PCR擴(kuò)skb，與所提取的開放閱讀框架中
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本文編號(hào)：2884295