發(fā)布時(shí)間：2020-11-15 03:38

　　 為了分析驗(yàn)證phaA、phaB和phaC三個(gè)基因的生物學(xué)功能，本實(shí)驗(yàn)采用PCR技術(shù)，從合成PHA的pseudomanas sp．菌株的亞克隆基因組片段中，分離出phaA、phaB和phaC三個(gè)基因片段，定向克隆至原核表達(dá)載體pBV220上，構(gòu)建了三個(gè)原核生物表達(dá)載體pBV-A、pBV-B和pBV-C，通過(guò)對(duì)表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)蛋白產(chǎn)物的SDS-PAGE分析、生物活性與功能分析，確定了基因phaA、phaB和phaC的生物學(xué)功能。結(jié)果表明： 1．利用所提取的開(kāi)放閱讀框架的序列設(shè)計(jì)三對(duì)引物，采用PCR技術(shù)，從合成PHA的亞克隆片段中分離出phaA、phaB和phaC三個(gè)基因片段，經(jīng)凝膠電泳分析表明，所克隆的三個(gè)基因分子量大小與推測(cè)的三個(gè)開(kāi)放閱讀框架中基因片段大小一致。 2．將phaA、phaB和phaC片段雙酶切后，定向克隆至原核表達(dá)載體pBV220，構(gòu)建了三個(gè)原核表達(dá)載體pBV-A、pBV-B和pBV-C；經(jīng)酶切分析表明，所克隆的三個(gè)基因phaA、phaB和phaC置于表達(dá)載體的正確閱讀框架下。 3．利用溫度誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后2小時(shí)外源基因開(kāi)始表達(dá)，所表達(dá)蛋白的量隨著時(shí)間的增加而增加，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為4小時(shí)后外源基因表達(dá)的增加量趨于平穩(wěn)，確定4小時(shí)為較為合適的誘導(dǎo)時(shí)間。 4．表達(dá)載體pBV-A、pBV-B和pBV-C經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)所表達(dá)的蛋白均為可溶性蛋白，沒(méi)有包涵體出現(xiàn)；蛋白經(jīng)SDS—PAGE分析表明，基因phaA表達(dá)的蛋白分子量為42kDa，與β—酮硫裂解酶分子量大小一致；基因phaB表達(dá)的蛋白分子量為26kDa，與乙酰乙酰CoA還原酶分子量大小一致；基因phaC表達(dá)的蛋白分子量為63kDa，與PHA合成酶分子量大小一致。 5．將phaA、phaB和phaC基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物混和后，加入底物乙酰CoA，于230nm—240nm波長(zhǎng)下，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在波長(zhǎng)235nm處有明顯的PHA特異吸收峰；表明混和物中有PHA的產(chǎn)生，所表達(dá)的蛋白具有生物學(xué)活性和特定功能，證實(shí)所克隆的phaA、phaB和phaC就是合成PHA所需的三個(gè)基因。
【學(xué)位單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：Q785
【部分圖文】：

phaA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果因的PCR產(chǎn)物;M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量PCRamPlifieationofPhaAproduetofPhaA;M:PCRmarker，GC含量為65%，在PCR擴(kuò)增的過(guò)提高擴(kuò)增的特異性。PCR擴(kuò)增的循環(huán)的三個(gè)步驟為:94℃變性1分鐘，鐘，最后于4℃保溫。擴(kuò)增結(jié)果如析表明，所擴(kuò)增片段的分子量約7B分子量大小一致。

2phaA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果A基因的PCR產(chǎn)物;M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分2PCRamPlifieationofPhaA:PCRproduetofPhaA;M:PCRmarbp，GC含量為65%，在PCR擴(kuò)增數(shù)來(lái)提高擴(kuò)增的特異性。PCR擴(kuò)增循環(huán)的三個(gè)步驟為:94℃變性110分鐘，最后于4℃保溫。擴(kuò)增泳分析表明，所擴(kuò)增片段的分子phaB分子量大小一致。

.skb，GC含量為66%，AT與GC分，GC同時(shí)出現(xiàn)8~IObp以上而沒(méi)的變性與復(fù)性過(guò)程中所產(chǎn)生二級(jí)溫度(62℃)來(lái)調(diào)整目的基因擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的循環(huán)程序?yàn)?94℃95℃變性1分鐘，62℃復(fù)性1分鐘溫。擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示:PCR擴(kuò)skb，與所提取的開(kāi)放閱讀框架中
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張?jiān)迄i;李志剛;;基于GIS的衛(wèi)生資源管理平臺(tái)的開(kāi)發(fā)[J];科技情報(bào)開(kāi)發(fā)與經(jīng)濟(jì);2011年19期

2 李石營(yíng);于斌;姚登兵;王勇軍;張占虎;顧曉松;;坐骨神經(jīng)缺損后大鼠近端神經(jīng)新miRNA的鑒定與功能分析[J];中國(guó)科學(xué):生命科學(xué);2011年07期

3 郭丹;;基于工作的人力資源管理的局限性及對(duì)策[J];河南科技;2011年15期

4 周玉娟;李凱;;基于價(jià)值工程的住宅小區(qū)智能化系統(tǒng)方案優(yōu)化[J];甘肅聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2011年04期

5 李楠楠;譚亮;王智平;王信超;廖智;;厚殼貽貝足絲黏附蛋白mfp-3重組表達(dá)及黏附功能分析[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2011年09期

6 王喬;黃飛;陳梅;郭星;;起重機(jī)的模塊化智能化參數(shù)化設(shè)計(jì)研究[J];科技信息;2011年15期

7 嵇鵬程;魏樹(shù)偉;;基于CAN總線的井下風(fēng)機(jī)綜合保護(hù)器的方案研究[J];科技資訊;2011年16期

8 慈凌坤;江力;狄東偉;張軍;盧云峰;曹樹(shù)青;;擬南芥耐硒突變體的篩選和鑒定[J];合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2011年06期

9 閻赟夢(mèng);李慶華;李杰;柴丹丹;薛樂(lè)勛;;杜氏鹽藻S腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及功能分析[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年04期

10 季煥淑;郭麗;;ASP動(dòng)態(tài)網(wǎng)頁(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)訪問(wèn)技術(shù)研究[J];科技致富向?qū)?2011年27期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李志勇;調(diào)控玉米大斑病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病性的CaM基因的克隆與功能分析[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

2 薩仁高娃;文昌魚(yú)含有DUF985和Phd-like-VIAF基序的理論蛋白基因的鑒定、表達(dá)和功能分析[D];中國(guó)海洋大學(xué);2007年

3 葛磊;水稻OsRAA1基因的克隆與功能分析[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（植物研究所）;2002年

4 范永山;玉米大斑病菌MAPK基因的克隆和功能分析[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

5 陳志雄;裸粒水稻花器官變異的形態(tài)發(fā)生、基因定位及功能研究[D];浙江大學(xué);2005年

6 曹志艷;玉米大斑病菌黑色素合成途徑相關(guān)基因的克隆及功能分析[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

7 聶秀玲;化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的克隆、定點(diǎn)突變及功能分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

8 趙翔宇;小麥花發(fā)育重要基因TaGI1與Ta MADS1的分離與功能分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

9 吳健敏;中國(guó)特有小型豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的檢測(cè)與全基因克隆[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

10 郝志敏;玉米大斑病菌G蛋白和磷脂酶C基因的克隆與功能分析[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 丁勇;PHA基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及功能分析[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

2 張立暉;三大新聞次語(yǔ)體的功能分析[D];哈爾濱工程大學(xué);2005年

3 陳新;稻瘟病菌兩個(gè)漆酶基因功能分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2008年

4 金雄成;我國(guó)信訪制度的合理性研究[D];延邊大學(xué);2008年

5 張新霞;英國(guó)思想庫(kù)及其功能分析[D];河北師范大學(xué);2004年

6 劉寧;價(jià)值工程方法在降低汽車零部件采購(gòu)成本中的運(yùn)用[D];吉林大學(xué);2009年

7 方明剛;棉鈴蟲(chóng)核多角體病毒的兩個(gè)保守基因Ha94與Ha132的功能分析[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（武漢病毒研究所）;2002年

8 陸竑;客戶關(guān)系管理在供電企業(yè)中的應(yīng)用研究[D];浙江大學(xué);2005年

9 李瑞鋒;價(jià)值工程在礦業(yè)工程中的應(yīng)用研究[D];遼寧工程技術(shù)大學(xué);2005年

10 林荊;墊狀卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因（SpTPS1）的克隆及其功能分析[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2884295