發(fā)布時(shí)間：2020-11-14 21:42

　　 前言 BSP蛋白是由精囊分泌的大量存在于牛精漿中的一個(gè)蛋白家族，其成員包括：BSP-A1，BSP-A2，BSP-A3，和BSP-30kDa四種蛋白質(zhì)。最初是由于可以促進(jìn)培養(yǎng)中的大鼠垂體前葉細(xì)胞分泌促性腺激素而被分離、純化的。但許多學(xué)者都認(rèn)為此作用所需濃度太高(10~(-6)M)，因而應(yīng)無(wú)重要的生理意義。BSP-A1／A2和A3的N-端都是天冬氨酸，C-端為半胱氨酸，并都含有兩對(duì)二硫鍵，由此形成了兩個(gè)基本相同的疏水結(jié)構(gòu)區(qū)。在每個(gè)疏水區(qū)中半胱氨酸殘基是按1—3和2—4順序形成二硫鍵，這樣構(gòu)成的胱氨酸多肽環(huán)被稱作Ⅱ型結(jié)構(gòu)，目前認(rèn)為Ⅱ型結(jié)構(gòu)是BSP蛋白多種功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 BSP蛋白是具有多種結(jié)合功能。Manjunath曾證明BSP蛋白可通過(guò)射精粘附于精子表面，并證明BSP蛋白與精子的結(jié)合位點(diǎn)是精子胞膜上的磷脂類。BSP蛋白還可與胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)、載脂蛋白A-I(apoA-I)、纖維蛋白原、肝素、鈣調(diào)蛋白等結(jié)合。BSP蛋白與精子的獲能及頂體反應(yīng)有密切關(guān)系。BSP蛋白還可促進(jìn)精子胞膜上的膽固醇外流，目前已有報(bào)導(dǎo)認(rèn)為精子胞膜上高濃度的膽固醇是妨礙獲能的一個(gè)重要原因。這些都暗示了BSP在精子胞膜的脂類代謝及調(diào)節(jié)精子的獲能及頂體反應(yīng)方面均發(fā)揮著重要作用。 目前在豬及馬的精漿中也都發(fā)現(xiàn)了與BSP蛋白同源的蛋白質(zhì)的存在。這些都說(shuō)明BSP蛋白及其同源蛋白在哺乳動(dòng)物中是廣泛存在的，并應(yīng)當(dāng)具有一定的生理意義。而在我們的實(shí)驗(yàn)中為了發(fā)現(xiàn)和研究BSP及其相關(guān)蛋白在受精卵的發(fā)育中的重要作用， 尋找 BSP相關(guān)的新基因，克隆了一個(gè)與 BSP蛋白相關(guān)基因的山一 NA序列并將該基因編碼的蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)和純 化，將純化后的融合蛋白作了一些生物學(xué)功能方面的初步工作，發(fā) 現(xiàn)新蛋白對(duì)TPK有一定的抑制作用，而TPK是細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝中 十分重要的關(guān)鍵酶，這對(duì)于進(jìn)一步研究新蛋白的生物學(xué)功能具有 十分重要的意義。 材料與方法 本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌 BIZI進(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng)，通 過(guò)堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，然后用限制性內(nèi)切酶BamH和Xho 雙酶切 37 T過(guò)夜，酶切產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定質(zhì)粒 DNA 的完整性與變異性。然后依據(jù)鑒定結(jié)果挑取陽(yáng)性單菌落在LB培 養(yǎng)基中大規(guī)模擴(kuò)增培養(yǎng)，將收集的菌體進(jìn)行超聲裂解離心后，分別 收集上清和沉淀，對(duì)沉淀中大量存在的包涵體進(jìn)行變性、洗滌、純 化和溶解，最后復(fù)性等多步處理，最后得到大量的表達(dá)的GST融 合蛋白，再經(jīng)過(guò)凝血因子 Xa酶切和 Gitathione－seph。sc 4B親 和層析純化后，得到純度較高的重組蛋白HBRP。實(shí)驗(yàn)中各步純 化和處理結(jié)果通過(guò) 10％SDS－PAGE來(lái)監(jiān)測(cè)目的蛋白去向，對(duì)于 最后得到的GST融合蛋白可通過(guò)抗GST抗體進(jìn)行免疫印跡雜交 來(lái)檢測(cè)。 我們從大鼠子宮中通過(guò)DEAE－52離子交換柱等純化得到 TPK樣品，收集有活性部分，一切操作在4t中進(jìn)行，然后觀察通 過(guò)基因工程得到的HBRP對(duì)TPK活性的影響。用Becklnan液閃 儀測(cè)定cPm值。蛋白定量采用酚試劑法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn) 蛋白。 ·二· 結(jié) 果 融合基因的正確性通過(guò)得到的表達(dá)質(zhì)粒的酶切和瓊脂糖電泳 顯示在預(yù)定位置 850hP和 5 e分別顯示了兩條帶。同預(yù)想結(jié)果基 本吻合，大規(guī)模培養(yǎng)后純化得到的融合蛋白通過(guò)SDS－PAGE顯 示在52KDa處有一條帶，而酶切后產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示在26KDa處 分另有兩條蛋白帶，其中一條為GST，另一條為HBRP，基本符合 實(shí)驗(yàn)結(jié)果；HBRP對(duì)TPK活性的抑制呈劑量依賴性。當(dāng) HBRP10g時(shí)可抑制其68％的活性。當(dāng)Li TPK活性下降的百分 數(shù)顯示重組蛋白HBny的抑制作用時(shí)，TPK活性（百分?jǐn)?shù)）的對(duì)數(shù) 與HBny的用量間存在線性關(guān)系。 討 論 BSP蛋白是牛精漿中大量存在的一個(gè)蛋白家族，包括BSP－ AI／AZ、BSP—A3、BSP—30KDa四種蛋白。已有各種證據(jù)顯示 BSP蛋白參與了精子的獲能過(guò)程甚至頂體反應(yīng)，獲能及頂體反應(yīng) 是受精過(guò)程的重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因重組技術(shù)獲得了大量的 表達(dá)蛋白，同時(shí)也初步探索了該表達(dá)蛋白的一些生物學(xué)活性作了 有益的嘗試。 通過(guò)大腸桿菌E．COlt BLZI生產(chǎn)融合蛋白，重組后的 DNA序 列包括一個(gè)PGEX質(zhì)粒，依照PGEX質(zhì)粒的融合蛋白的表達(dá)是在 tao啟動(dòng)子的控制之下，而枯 啟動(dòng)子可由乳糖的類似物I剛來(lái) 誘導(dǎo)它表達(dá)。PGEX載體攜帶有l(wèi)ac’基因，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，在此 條件下的質(zhì)粒的繁殖和融合蛋白的表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)特異性要 求，但經(jīng)典實(shí)驗(yàn)多采用E．COliBLZI作為宿主細(xì)胞。 原核表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)效率高，操作方便等特點(diǎn)，但缺乏翻譯 ·3· 后修飾，以PGEX載體表達(dá)的GST－HBRP融合蛋白，具有表達(dá)的 蛋白穩(wěn)定性好，在體外易于純化等優(yōu)點(diǎn)，表達(dá)的GST融合蛋白可 用 Gluthione Seph刪sc 4 B進(jìn)一步純化一Factor Xa酶切與測(cè)分 離，從而大量獲得HBRP重組蛋白，而且一次回收率大約在90％ 以上。在溫和的非變性條件下可保持蛋白的抗原性和生物學(xué)功 能，在此基礎(chǔ)
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2002
【中圖分類】：Q51
【文章目錄】：
一、 中文摘要
二、 英文摘要
三、 英文縮略語(yǔ)
四、 前言
五、 實(shí)驗(yàn)材料
六、 實(shí)驗(yàn)方法
七、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
八、 討論
九、 結(jié)論
十、 論文圖片
十一、 參考文獻(xiàn)
十二、 致謝
十三、 個(gè)人簡(jiǎn)介

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 黃蓬,繆時(shí)英,王琳芳;一種抑制pGEX載體系統(tǒng)本底表達(dá)的方法[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1998年01期

2 劉新光,梁念慈,馬澗泉;重組人蛋白激酶CK 2α亞基的原核表達(dá)、純化與鑒定[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2000年01期

3 羅陽(yáng),張學(xué),劉瑩,姜莉,劉興元,于秉治;人牛精漿蛋白相關(guān)新基因的cDNA克隆、定位和表達(dá)[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2002年02期

本文編號(hào)：2883983