HBRP的表達、純化與生物學(xué)活性分析
發(fā)布時間:2020-11-14 21:42
前言 BSP蛋白是由精囊分泌的大量存在于牛精漿中的一個蛋白家族,其成員包括:BSP-A1,BSP-A2,BSP-A3,和BSP-30kDa四種蛋白質(zhì)。最初是由于可以促進培養(yǎng)中的大鼠垂體前葉細(xì)胞分泌促性腺激素而被分離、純化的。但許多學(xué)者都認(rèn)為此作用所需濃度太高(10~(-6)M),因而應(yīng)無重要的生理意義。BSP-A1/A2和A3的N-端都是天冬氨酸,C-端為半胱氨酸,并都含有兩對二硫鍵,由此形成了兩個基本相同的疏水結(jié)構(gòu)區(qū)。在每個疏水區(qū)中半胱氨酸殘基是按1—3和2—4順序形成二硫鍵,這樣構(gòu)成的胱氨酸多肽環(huán)被稱作Ⅱ型結(jié)構(gòu),目前認(rèn)為Ⅱ型結(jié)構(gòu)是BSP蛋白多種功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 BSP蛋白是具有多種結(jié)合功能。Manjunath曾證明BSP蛋白可通過射精粘附于精子表面,并證明BSP蛋白與精子的結(jié)合位點是精子胞膜上的磷脂類。BSP蛋白還可與胰島素樣生長因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)、載脂蛋白A-I(apoA-I)、纖維蛋白原、肝素、鈣調(diào)蛋白等結(jié)合。BSP蛋白與精子的獲能及頂體反應(yīng)有密切關(guān)系。BSP蛋白還可促進精子胞膜上的膽固醇外流,目前已有報導(dǎo)認(rèn)為精子胞膜上高濃度的膽固醇是妨礙獲能的一個重要原因。這些都暗示了BSP在精子胞膜的脂類代謝及調(diào)節(jié)精子的獲能及頂體反應(yīng)方面均發(fā)揮著重要作用。 目前在豬及馬的精漿中也都發(fā)現(xiàn)了與BSP蛋白同源的蛋白質(zhì)的存在。這些都說明BSP蛋白及其同源蛋白在哺乳動物中是廣泛存在的,并應(yīng)當(dāng)具有一定的生理意義。而在我們的實驗中為了發(fā)現(xiàn)和研究BSP及其相關(guān)蛋白在受精卵的發(fā)育中的重要作用, 尋找 BSP相關(guān)的新基因,克隆了一個與 BSP蛋白相關(guān)基因的山一 NA序列并將該基因編碼的蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞中進行了表達和純 化,將純化后的融合蛋白作了一些生物學(xué)功能方面的初步工作,發(fā) 現(xiàn)新蛋白對TPK有一定的抑制作用,而TPK是細(xì)胞生長和代謝中 十分重要的關(guān)鍵酶,這對于進一步研究新蛋白的生物學(xué)功能具有 十分重要的意義。 材料與方法 本實驗首先對轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌 BIZI進行小規(guī)模培養(yǎng),通 過堿裂解法提取質(zhì)粒DNA,然后用限制性內(nèi)切酶BamH和Xho 雙酶切 37 T過夜,酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定質(zhì)粒 DNA 的完整性與變異性。然后依據(jù)鑒定結(jié)果挑取陽性單菌落在LB培 養(yǎng)基中大規(guī)模擴增培養(yǎng),將收集的菌體進行超聲裂解離心后,分別 收集上清和沉淀,對沉淀中大量存在的包涵體進行變性、洗滌、純 化和溶解,最后復(fù)性等多步處理,最后得到大量的表達的GST融 合蛋白,再經(jīng)過凝血因子 Xa酶切和 Gitathione-seph。sc 4B親 和層析純化后,得到純度較高的重組蛋白HBRP。實驗中各步純 化和處理結(jié)果通過 10%SDS-PAGE來監(jiān)測目的蛋白去向,對于 最后得到的GST融合蛋白可通過抗GST抗體進行免疫印跡雜交 來檢測。 我們從大鼠子宮中通過DEAE-52離子交換柱等純化得到 TPK樣品,收集有活性部分,一切操作在4t中進行,然后觀察通 過基因工程得到的HBRP對TPK活性的影響。用Becklnan液閃 儀測定cPm值。蛋白定量采用酚試劑法,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn) 蛋白。 ·二· 結(jié) 果 融合基因的正確性通過得到的表達質(zhì)粒的酶切和瓊脂糖電泳 顯示在預(yù)定位置 850hP和 5 e分別顯示了兩條帶。同預(yù)想結(jié)果基 本吻合,大規(guī)模培養(yǎng)后純化得到的融合蛋白通過SDS-PAGE顯 示在52KDa處有一條帶,而酶切后產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示在26KDa處 分另有兩條蛋白帶,其中一條為GST,另一條為HBRP,基本符合 實驗結(jié)果;HBRP對TPK活性的抑制呈劑量依賴性。當(dāng) HBRP10g時可抑制其68%的活性。當(dāng)Li TPK活性下降的百分 數(shù)顯示重組蛋白HBny的抑制作用時,TPK活性(百分?jǐn)?shù))的對數(shù) 與HBny的用量間存在線性關(guān)系。 討 論 BSP蛋白是牛精漿中大量存在的一個蛋白家族,包括BSP- AI/AZ、BSP—A3、BSP—30KDa四種蛋白。已有各種證據(jù)顯示 BSP蛋白參與了精子的獲能過程甚至頂體反應(yīng),獲能及頂體反應(yīng) 是受精過程的重要環(huán)節(jié)。本實驗通過基因重組技術(shù)獲得了大量的 表達蛋白,同時也初步探索了該表達蛋白的一些生物學(xué)活性作了 有益的嘗試。 通過大腸桿菌E.COlt BLZI生產(chǎn)融合蛋白,重組后的 DNA序 列包括一個PGEX質(zhì)粒,依照PGEX質(zhì)粒的融合蛋白的表達是在 tao啟動子的控制之下,而枯 啟動子可由乳糖的類似物I剛來 誘導(dǎo)它表達。PGEX載體攜帶有l(wèi)ac’基因,根據(jù)文獻報導(dǎo),在此 條件下的質(zhì)粒的繁殖和融合蛋白的表達對宿主細(xì)胞無特異性要 求,但經(jīng)典實驗多采用E.COliBLZI作為宿主細(xì)胞。 原核表達系統(tǒng)具有表達效率高,操作方便等特點,但缺乏翻譯 ·3· 后修飾,以PGEX載體表達的GST-HBRP融合蛋白,具有表達的 蛋白穩(wěn)定性好,在體外易于純化等優(yōu)點,表達的GST融合蛋白可 用 Gluthione Seph刪sc 4 B進一步純化一Factor Xa酶切與測分 離,從而大量獲得HBRP重組蛋白,而且一次回收率大約在90% 以上。在溫和的非變性條件下可保持蛋白的抗原性和生物學(xué)功 能,在此基礎(chǔ)
【學(xué)位單位】:中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位年份】:2002
【中圖分類】:Q51
【文章目錄】:
一、 中文摘要
二、 英文摘要
三、 英文縮略語
四、 前言
五、 實驗材料
六、 實驗方法
七、 實驗結(jié)果
八、 討論
九、 結(jié)論
十、 論文圖片
十一、 參考文獻
十二、 致謝
十三、 個人簡介
【參考文獻】
本文編號:2883983
【學(xué)位單位】:中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位年份】:2002
【中圖分類】:Q51
【文章目錄】:
一、 中文摘要
二、 英文摘要
三、 英文縮略語
四、 前言
五、 實驗材料
六、 實驗方法
七、 實驗結(jié)果
八、 討論
九、 結(jié)論
十、 論文圖片
十一、 參考文獻
十二、 致謝
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【參考文獻】
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1 黃蓬,繆時英,王琳芳;一種抑制pGEX載體系統(tǒng)本底表達的方法[J];生物化學(xué)與生物物理進展;1998年01期
2 劉新光,梁念慈,馬澗泉;重組人蛋白激酶CK 2α亞基的原核表達、純化與鑒定[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2000年01期
3 羅陽,張學(xué),劉瑩,姜莉,劉興元,于秉治;人牛精漿蛋白相關(guān)新基因的cDNA克隆、定位和表達[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2002年02期
本文編號:2883983
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